干旱環(huán)境脅迫下的植物分子適應(yīng)機(jī)理及其應(yīng)用研究.pdf

1、干旱是影響植物正常代謝和生長(zhǎng)發(fā)育最主要非生物脅迫因子之一，對(duì)我國(guó)城市綠化建設(shè)和農(nóng)業(yè)發(fā)展有著嚴(yán)重的影響。脫水素和CBF轉(zhuǎn)錄因子分別是植物在干旱脅迫應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生的功能性蛋白和調(diào)節(jié)性蛋白，它們?cè)谥参锟购颠^(guò)程中起著重要的作用。但是目前有關(guān)它們?cè)谥参锟购祷蚬こ讨袘?yīng)用的資料還很缺乏，尚需要進(jìn)一步深入研究。本研究從薺菜中克隆了一條新的脫水素基因(cor29)，并采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將cor29基因和CBF基因Cbcbf25的全長(zhǎng)eDNA轉(zhuǎn)入煙草，以期

2、為植物的抗旱基因工程研究提供依據(jù)和參考。本研究的主要結(jié)果如下： 1.薺菜脫水素基因cor29全長(zhǎng)cDNA的克隆及其特征分析 本研究采用序列同源克隆策略，結(jié)合RACE技術(shù)從薺菜中克隆出了一個(gè)新的脫水素基因的全長(zhǎng)eDNA序列，命名為cor29(GenBank,AY513787)。該eDNA全長(zhǎng)1110bp，包含了1個(gè)783bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼261個(gè)氨基酸。根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)的蛋白(COR29)的分子量(Mw)為

3、29．36kD，等電點(diǎn)pI為4．93。氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析顯示COR29具有脫水素家族的幾個(gè)典型特征。首先COR29蛋白具有高比例的親水性氨基酸組成，具有較強(qiáng)的親水性。第二，序列中具有3個(gè)為脫水素家族高度保守的K-片斷(K-segment)。另外，序列的中部位置有一個(gè)連續(xù)的絲氨酸束，即S-片段(S-segment)，且位于第一個(gè)K-片斷之前。BLAST搜索(EXPASY／UniProt)結(jié)果表明COR29蛋白與大多數(shù)已知的脫水素具有較高

4、的同源性。結(jié)構(gòu)與功能分析表明COR29蛋白在干旱環(huán)境脅迫下可通過(guò)其豐富的親水性氨基酸和可形成兼親性a-螺旋的K-片段保護(hù)細(xì)胞免受脫水傷害。半定量RT-PCR結(jié)果表明cor29基因的表達(dá)受外源性ABA、干旱或低溫脅迫的影響。推測(cè)cor29基因的表達(dá)至少存在著兩條途徑：一條是依賴(lài)于ABA但不需要特殊蛋白合成的信號(hào)傳導(dǎo)途徑Ⅱ，另外一條是不依賴(lài)于ABA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑Ⅳ。 2．cor29和Cbcbf25全長(zhǎng)cDNA的植物表達(dá)載體構(gòu)建

5、 本研究采用pCAMBIA2301作為所克隆基因的表達(dá)載體骨架，將采用EcoRI／HindⅢ雙酶切從pBI121質(zhì)粒上切下的gus基因表達(dá)盒連接到用同樣雙酶切開(kāi)環(huán)的pCAMBIA2301的多克隆位點(diǎn)中，形成中間載體p2301-gus。插入的gus表達(dá)盒的CaMV35S啟動(dòng)子后面可供采用的酶切位點(diǎn)有3個(gè)，它們依次是XbaI、BamHI和)XmaI／SimaI，終止子前面可供采用的酶切位點(diǎn)為SacI。設(shè)計(jì)帶有所需酶切位點(diǎn)序列的PCR引物，

6、從植物總cDNA分別擴(kuò)增獲得目基因片斷。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，帶相應(yīng)目的基因片斷的pGEM-TEasy載體采用相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行完全雙酶切，分別回收獲得帶BamHI／SacI粘性末端的cor29全長(zhǎng)cDNA片斷和帶XmaI／SacI粘性末端的Cbcbf25全長(zhǎng)cDNA片斷。同時(shí)對(duì)載體p2301-gus分別采用BamHI／SacI和)XmaI／SacI雙酶切，切下gus基因后回收載體骨架。將對(duì)應(yīng)的載體骨架與目的基因進(jìn)行連接，即可得到分別攜帶

7、cor29和Cbcbf25基因全長(zhǎng)cDNA的植物表達(dá)載體p2301-cor29和p2301-Cbcbf25。將其先轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。 此外，我們構(gòu)建了適合遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物的表達(dá)載體pDB-Cbcbf25,目的基因Cbcbf25由玉米泛素Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，hpt基因作為選擇標(biāo)記基因，可用來(lái)遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物。 3．cor29和Cbcbf25全長(zhǎng)cDNA采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草的研究 本研究采用含有植

8、物表達(dá)載體p2301-cor29和p2301-Cbcbf25的根癌農(nóng)桿菌菌株EHAl05進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化的葉盤(pán)法操作，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、誘導(dǎo)不定芽、生根移栽后分別獲得轉(zhuǎn)cor29基因的再生苗35株和轉(zhuǎn)Cbcbf25基因的再生苗23株。對(duì)這些再生苗進(jìn)行葉片卡那霉素抗性鑒定的結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)cor29基因的再生苗中，有完全抗卡的6株，部分抗卡的6株，完全不抗卡的23株；在轉(zhuǎn)Cbcbf25基因的再生苗中，有完全抗卡的5株，部分抗卡的3株，完全不抗卡的15