不同冷凍方法對(duì)人精子受精能力的影響.pdf

1、精子冷凍技術(shù)可以有效地保存男性生育能力，與輔助生殖技術(shù)結(jié)合使用為眾多不孕夫婦帶來(lái)了新希望。經(jīng)過(guò)專(zhuān)家學(xué)者們多年來(lái)不懈的研究和探索，目前有多種冷凍方法可供選擇，包括程序化慢速冷凍、液氮蒸汽冷凍以及精子玻璃化冷凍等，各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，程序化冷凍效果值得肯定，但儀器價(jià)格高昂，操作費(fèi)時(shí)；液氮蒸汽法利用液氮蒸汽產(chǎn)生的溫度梯度進(jìn)行冷凍，因其操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)較少得到廣泛應(yīng)用，但冷凍速率不夠穩(wěn)定可能會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生損傷；玻璃化冷凍技術(shù)通過(guò)超高降溫速率減少胞內(nèi)

2、冰晶形成帶來(lái)的機(jī)械損傷，不使用高濃度的冷凍保護(hù)劑，減小了對(duì)精子的滲透性損傷，復(fù)蘇后精子活力、活率、精子核DNA完整率得到提高，但冷凍體積小，常用于嚴(yán)重少弱精子癥和睪丸附睪穿刺取精患者微量精子的保存。因此，如何增加玻璃化冷凍的體積，從而將玻璃化冷凍應(yīng)用于常規(guī)精液成為精子冷凍技術(shù)的研究熱點(diǎn)。
　　目的：使用常規(guī)塑料冷凍管作為載體對(duì)正常人群精液進(jìn)行大體積快速冷凍和常規(guī)液氮蒸汽冷凍，觀(guān)察比較兩組精液冷凍前后精子活力、存活率、形態(tài)、頂體酶含

3、量、精子核DNA完整性等參數(shù)的變化。通過(guò)與常規(guī)冷凍技術(shù)進(jìn)行比較，探討分析大體積精液快速冷凍對(duì)精子受精能力的影響，以及該技術(shù)在臨床應(yīng)用的可行性。
　　方法：精液標(biāo)本取自2016年9月~2017年1月期間就診于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科的35位患者，患者無(wú)梅毒、艾滋、乙肝等傳染疾病，在征得患者同意后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。患者年齡27~38歲，禁欲時(shí)間控制在2~7天，通過(guò)手淫法收集精液于無(wú)菌取精杯中，待精液液化后，根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類(lèi)精液檢查

4、與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第五版）對(duì)樣本進(jìn)行精液常規(guī)分析和形態(tài)學(xué)檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：液化時(shí)間≤1h，精液量≥1.5ml，精子濃度≥40×106/ml，活動(dòng)率≥40％。將符合標(biāo)準(zhǔn)的精液樣本進(jìn)行密度梯度離心處理，處理后精子懸液平均分為3組：A組，新鮮精液組；B組，采用常規(guī)液氮蒸汽法，使用自制蛋黃-甘油-檸檬酸鈉精子冷凍液冷凍；C組，采用大體積快速冷凍法，使用蔗糖溶液冷凍，與精液混合后蔗糖終濃度為0.25M。B、C兩組中精液與保護(hù)劑比例為1:1，逐滴向

5、精液中加入冷凍保護(hù)劑，邊加入邊搖晃。精液標(biāo)本冷凍儲(chǔ)存1周后，從液氮中取出，立即放入36℃水浴箱內(nèi)解凍復(fù)溫10分鐘，加入1ml洗精液（36℃、6%CO2平衡過(guò)夜），200g離心10分鐘，棄上清，加入0.5ml洗精液重懸精子。對(duì)各組精液活力、存活率、形態(tài)、頂體酶含量、精子核DNA完整性、處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)（Post-wash total mobile sperm count, PTMC）進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.冷凍后

6、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比、存活率、精子DNA完整性、頂體酶含量均低于新鮮精液，畸形率則高于新鮮組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P<0.05。
　　2.C組前向運(yùn)動(dòng)精子百分比、存活率、處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)稍高于B組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均>0.05。
　　3.B組精子畸形率高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。
　　4.C組精子DNA完整性稍高于B組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。
　　5.C組精子頂體酶活性高