鹽酸小檗堿對(duì)慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能的改善作用.pdf

1、背景與目的:
　　腦卒中是目前嚴(yán)重危害人類健康與生命安全的常見(jiàn)病、難治病，根據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)我國(guó)發(fā)生腦卒中的患者多達(dá)200余萬(wàn)/年，幸存700萬(wàn)余人，其中約450萬(wàn)患者已生活不能完全自理，患病率、病殘率遠(yuǎn)高于其他發(fā)達(dá)與發(fā)展中國(guó)家，足以證明腦卒中是影響壽命的第三大殺手。臨床上腦卒中主要包括缺血性與出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中較為多見(jiàn)。腦組織缺血可引起能量代謝障礙產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、凋亡等連鎖反應(yīng)，甚至喪失其功能，從而導(dǎo)致一系

2、列中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥候。腦卒中及相關(guān)腦血管?。X低灌注致記憶、認(rèn)知和行為改變）可致嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征。近些年的研究可知，造成缺血性腦損傷重要的始動(dòng)因素—能量代謝障礙，其機(jī)制包括能量供應(yīng)不足后引起的代謝性酸中毒、氧化應(yīng)激性損傷、電解質(zhì)紊亂、突觸后細(xì)胞膜過(guò)度去極化、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等。文獻(xiàn)表明，細(xì)胞能量的感受器—單磷酸腺苷活化蛋白激酶—在心臟病、肥胖、糖尿病等能量代謝障礙性疾病中發(fā)揮重要作用；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白—證實(shí)在能量代謝障礙疾病

3、的研究領(lǐng)域中同樣起關(guān)鍵作用。
　　小檗堿（又名黃連素），是一種存在于（小檗科等四個(gè)科十個(gè)屬）繁多植物中常見(jiàn)的異喹啉生物堿，分子式C20H18NO4。最初提取后廣泛制成清熱解毒與抗菌藥物應(yīng)用于臨床，近些年深入研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可能是一種對(duì)治療心腦血管病、高尿酸癥、高脂血癥、糖尿病及許多慢性炎癥性疾病的藥物，備受心腦系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域關(guān)注，但是目前對(duì)小檗堿的研究多集中在急性腦血管病及神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變方面，癡呆方面的研究多數(shù)集中在阿爾茨海

4、默?。ˋD），對(duì)于慢性腦缺血方面的研究相對(duì)較少，小檗堿是否可以通過(guò)單磷酸腺苷活化蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（AMPK/mTOR）信號(hào)通路改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知功能，還不得而知。本實(shí)驗(yàn)采用Wistar大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性阻斷法建立2VO大鼠的慢性腦缺血模型，并給予小檗堿腹腔注射（40mg·kg-1）14天，應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)法、TUNEL法、蛋白質(zhì)免疫印跡法觀察小檗堿通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路對(duì)慢性

5、腦缺血大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用。
　　材料與方法:
　　選取約24周齡健康雄性Wistar大鼠180只，體重約250±30g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)中心提供，隨機(jī)分為三組，分別為假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組，每組60只，模型組與干預(yù)組應(yīng)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性阻斷法(2VO)造模，假手術(shù)組除不結(jié)扎血管外余步驟同模型組。三組設(shè)置給藥后2、4、8周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)20只。干預(yù)組大鼠每天給予小檗堿（40mg·kg-1·d）腹腔注射14天

6、，術(shù)后2、4、8周時(shí)，分別通過(guò)Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠的認(rèn)知功能，免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)AMPK、mTOR表達(dá)變化，TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)大鼠海馬組織中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.行為學(xué)觀察：三個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比較，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，假手術(shù)組大鼠平均逃避潛伏期無(wú)明顯變化(P>0.05)；三組間同一時(shí)間點(diǎn)比較，干預(yù)組

7、與模型組的平均逃避潛伏期均較假手術(shù)組顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；干預(yù)組較模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著縮短，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：
　　AMPK：假手術(shù)組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯差別(P>0.05)；模型組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組明顯減少(P<0.05)；2周、4周干預(yù)組免疫細(xì)胞數(shù)目較模型組明顯減少，8周時(shí)增加(P<0.05)。
　　mTOR：假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)比

8、較，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組和干預(yù)組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目相對(duì)減少；與模型組相比，干預(yù)組免疫細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)；模型組與干預(yù)組，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目呈遞增趨勢(shì)(P<0.05)。
　　3.TUNEL法凋亡檢測(cè)結(jié)果：鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)，假手術(shù)組可見(jiàn)極個(gè)別TUNEL標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞；模型組、干預(yù)組可見(jiàn)較多散在分布的陽(yáng)性細(xì)胞，出現(xiàn)明顯凋亡。數(shù)據(jù)處理結(jié)果：模型組和干預(yù)組與假手術(shù)組

9、相比陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；干預(yù)組較模型組陽(yáng)性細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組和干預(yù)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)組內(nèi)（8周與4周、4周與2周）比較，隨著時(shí)間的推移，凋亡明顯加重（P<0.05）。
　　4.Western blot結(jié)果：各組大鼠海馬組織內(nèi)AMPK、mTOR的表達(dá)活性采用p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR來(lái)說(shuō)明。假手術(shù)組三個(gè)時(shí)間點(diǎn) AMPK的活性極弱，基本處于抑制狀態(tài)（ P

10、>0.05），與假手術(shù)組相比，模型組與干預(yù)組p-AMPK/AMPK比值顯著升高（P<0.05），與模型組相比，干預(yù)組p-AMPK/AMPK比值明顯升高（P<0.05），隨著缺血狀態(tài)的持續(xù)，活性逐漸降低（P<0.05）；假手術(shù)組三個(gè)時(shí)間點(diǎn) mTOR的活性無(wú)明顯變化，與假手術(shù)組相比，模型組與干預(yù)組p-mTOR/mTOR比值顯著減少（P<0.05），與模型組相比，干預(yù)組p-mTOR/mTOR比值明顯降低（P<0.05），隨著缺血狀態(tài)的持續(xù)，活

11、性進(jìn)一步降低（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.慢性腦缺血狀態(tài)可影響大鼠海馬區(qū)AMPK、mTOR的表達(dá)，一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AMPK活性增加、mTOR活性降低，二者呈相互拮抗時(shí)向關(guān)系。
　　2.鹽酸小檗堿可調(diào)控慢性腦缺血大鼠海馬區(qū)AMPK、mTOR的表達(dá)，一定的時(shí)間范圍內(nèi)，表現(xiàn)為隨著時(shí)間延長(zhǎng)AMPK活性進(jìn)一步增加，mTOR活性進(jìn)一步降低。
　　3.慢性腦缺血持續(xù)狀態(tài)可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能下降，應(yīng)用鹽酸