烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響.pdf

1、研究背景：
　　 隨著人口老齡化程度的加劇,腦血管疾病已成為一個(gè)倍受社會(huì)關(guān)注的問題。慢性腦缺血是腦血管疾病主要病理基礎(chǔ),嚴(yán)重危害人類的健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)中老年人群中有2/3的人患有慢性腦供血不足,屬中老年人多發(fā)病。慢性腦缺血是腦灌流動(dòng)脈狹窄或閉塞所引起的一種很常見的缺血性腦血管疾病。臨床表現(xiàn)主要為頭暈、頭痛、失眠、肢體麻木、記憶力減退、情緒低落等,反復(fù)發(fā)作,時(shí)輕時(shí)重、無神經(jīng)系統(tǒng)局灶性定位體征為其主要特點(diǎn)。
　　 針對(duì)慢性腦缺血

2、最明顯的早發(fā)癥狀之一是學(xué)習(xí)記憶減退,目前大量實(shí)驗(yàn)研究主要集中在模型動(dòng)物的行為學(xué),皮質(zhì)、海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)、神經(jīng)生化學(xué)、腦血流等指標(biāo)的研究領(lǐng)域上。各種慢性腦缺血模型用迷宮試驗(yàn)研究大鼠的行為學(xué)改變,提示慢性腦缺血損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。海馬是哺乳動(dòng)物完成學(xué)習(xí)和記憶活動(dòng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),海馬也是腦缺血最敏感的區(qū)域,是腦內(nèi)參與記憶儲(chǔ)存功能的重要部分。谷氨酸在學(xué)習(xí)和記憶及神經(jīng)元可塑件方面均起重要作用,N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-Methyl-D-as

3、partate receptor,NMDAR)是谷氨酸的配基和電壓雙門控離子通道,主要分布在突觸后膜；它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有特殊的雙面性,生理上與學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān)。NR2B亞基被命名為“聰明基因”,提出該基因就是記憶基因的論斷。
　　 中醫(yī)學(xué)沒有慢性腦供血不足病名,但“眩暈”、“頭痛”、“失眠”、“健忘”等歸屬此病。歷代醫(yī)家有“無虛不作?！?、“無瘀不作眩”之說。其病位在腦,以虛為本,由于病程遷延,往往多因兼見,虛實(shí)并存。“烏

4、龍丹”系國家級(jí)名老中醫(yī)臧堃堂教授臨床經(jīng)驗(yàn)方,該方以補(bǔ)腎填精,健脾化痰,活血通絡(luò)立法:在臨床上常用于治療缺血性腦病,效果顯著。我們課題組早期的實(shí)驗(yàn)研究表明,“烏龍丹”有多方面的藥理作用,能從不同途徑改善腦缺血后的病理變化；并能改善多發(fā)性腦梗塞癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的功能,但針對(duì)烏龍丹防治慢性腦供血不足致學(xué)習(xí)記憶減退的作用及其機(jī)理尚未進(jìn)行研究。
　　 目的：
　　 本研究通過復(fù)制慢性腦缺血模型,探討慢性腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能的變化及

5、“烏龍丹”的作用,揭示慢性腦缺血與認(rèn)知障礙的關(guān)系,為“烏龍丹”臨床防治慢性腦供血不足及相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、受試藥物
　　 烏龍丹
　　 2、動(dòng)物模型制作及分組
　　 采用永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作慢性腦缺血大鼠模型。假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,不結(jié)扎,其余處理同手術(shù)組。大鼠造模后3周,存活大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分組。實(shí)驗(yàn)5組,每組17只,分別是假手術(shù)組、模型組、烏龍丹

6、高劑量組、烏龍丹低劑量組、銀杏葉組。烏龍丹高劑量組(相當(dāng)于生藥量8.8g/kg.d)、烏龍丹低劑量組(相當(dāng)于生藥量4.4 g/kg.d)、銀杏葉組(約含總黃酮醇苷460 mg/kg.d),假手術(shù)組和模型組灌服等量生理鹽水。每日灌胃1次,連續(xù)5周。
　　 3、觀察指標(biāo):
　　 3.1大鼠Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)搜索策略的變化
　　 3.2大鼠Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的觀測(cè)
　　 3.3

7、大鼠Morris水迷宮空間搜索能力的變化
　　 3.4大鼠避暗實(shí)驗(yàn)潛伏期時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)觀測(cè)
　　 3.5大鼠皮層血流量的測(cè)定
　　 3.6大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)觀察及CA1區(qū)神經(jīng)元密度比較
　　 3.7 NR1/NR2B在大鼠海馬及皮層中的表達(dá)
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,結(jié)果比較運(yùn)用重復(fù)測(cè)量方差分析,單因素方差分析

8、(One-way ANOVA),組間多重比較方差齊時(shí)用LSD方法,不齊時(shí)用Dunnett's T3。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.結(jié)果:
　　 5.1烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)搜索策略的影響
　　 在最初的訓(xùn)練中,大鼠尋找平臺(tái)的搜索策略主要是邊緣式和隨機(jī)式；隨著訓(xùn)練次數(shù)增加除模型組動(dòng)物仍有大部分保持此搜索策略外,假手術(shù)、銀杏葉組及烏龍丹高、低劑量組均主要以直線式和趨向式。<

9、br>　　 5.2烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響
　　 各組大鼠在5 d訓(xùn)練過程中尋找平臺(tái)潛伏期,隨著訓(xùn)練時(shí)間增加,潛伏期越來越短,表明大鼠在訓(xùn)練過程中已逐漸學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)。采用重復(fù)測(cè)量和單因素方差分析,時(shí)間點(diǎn)和組別之間有交互效應(yīng)(F=2.096,P=0.031)；組別之間有主效應(yīng)(F=7.403,P=0.000)；各時(shí)間點(diǎn)間有主效應(yīng)(F=906.786,P=0.000),需進(jìn)行兩兩比較。結(jié)

10、果表明,與模型組比較,烏龍丹高、低劑量組和銀杏葉組均能縮短潛伏期時(shí)間,且第3天～5天潛伏期時(shí)間有顯著性意義(P<0.05)。
　　 5.3烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠Morris水迷宮空間搜索能力的影響
　　 各組大鼠在原平臺(tái)停留時(shí)間經(jīng)One-way ANOVA分析組間有顯著性差異(F=7.245,P=0.000)；各組大鼠穿越原平臺(tái)象限路程經(jīng)One-way ANOVA分析組間也有顯著性差異(F=11.635,P=0.000)

11、；需進(jìn)一步兩兩比較。結(jié)果:假手術(shù)組、烏龍丹高、低劑量組及銀杏葉組在原平臺(tái)象限停留時(shí)間和穿越原平臺(tái)象限路程均多于模型組(P<0.01)。假手術(shù)組與烏龍丹低劑量組和銀杏葉組比較,原平臺(tái)象限停留時(shí)間增多、穿越原平臺(tái)路程增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但與烏龍丹高劑量組比較,無明顯差異(P=0.112)。
　　 5.4大鼠避暗實(shí)驗(yàn)
　　 各組大鼠潛伏期時(shí)間經(jīng)One-way ANOVA分析組間有顯著性差異(F=6.858

12、,P=0.000)；各組大鼠錯(cuò)誤次數(shù)經(jīng)One-way ANOVA分析組間也有顯著性差異(F=24.795,P=0.000)；需進(jìn)一步兩兩比較。結(jié)果:模型組與假手術(shù)組比較,潛伏期明顯縮短(P<0.01),錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P<0.01)；銀杏葉組和烏龍丹高、低劑量組與模型組比較差異顯著(P<0.01),潛伏期延長(zhǎng),錯(cuò)誤次數(shù)減少。
　　 5.5大鼠皮層血流量的測(cè)定
　　 各組大鼠皮層血流量數(shù)據(jù)經(jīng)One-way ANOVA分析

13、組間有顯著性差異(F/welch=19.384,P=0.000),需進(jìn)一步兩兩比較(采用LSD法)。結(jié)果:假手術(shù)組、烏龍丹高、低劑量組及銀杏葉組的大鼠皮層rCBF均高于模型組,差異具有顯著性(P<0.01)；但烏龍丹高、低劑量組及銀杏葉組的大鼠皮層血流均低于假手術(shù)組,差異也具有顯著性(P<0.01)。
　　 5.6腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元組織病理形態(tài)學(xué)觀察
　　 HE染色后假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則,層次豐富

14、,神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊密集、細(xì)胞間隙正常,細(xì)胞輪廓清楚,核居中,細(xì)胞突起清晰可見；模型組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞層數(shù)不完整,神經(jīng)元排列紊亂、松散,細(xì)胞間隙明顯,核固縮過半,細(xì)胞間隙水腫,可見明顯凝固性壞死和細(xì)胞脫失；烏龍丹高劑量組海馬CA1區(qū)與假手術(shù)組比較,除外層神經(jīng)元細(xì)胞有部分脫失和核固縮外,其余無明顯差異；烏龍丹低劑量組和銀杏葉片組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)介于烏龍丹高劑量組和模型組之間,可明顯減輕模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞脫失現(xiàn)象。
　　

15、 神經(jīng)元密度觀察:各組大鼠神經(jīng)元密度數(shù)據(jù)經(jīng)One-way ANOVA分析組間有顯著性差異(F=160.545,P=0.001),需經(jīng)一步兩兩比較(采用LSD法)。結(jié)果:各組與模型組比較,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度均大于模型組(P<0.001),而各組和假手術(shù)組比較也存在顯著差異(P<0.001)。
　　 尼氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊規(guī)則,胞漿染色清晰且虎斑豐富,胞核淡染；但模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元

16、細(xì)胞排列散亂,神經(jīng)元胞體腫脹,核固縮、凝聚,胞漿內(nèi)虎斑明顯減少,提示尼氏小體大量溶解；各給藥組神經(jīng)元病變均輕于模型組,可見部分神經(jīng)元細(xì)胞和尼氏小體減少,烏龍丹高劑量組改善最為明顯,僅有少量神經(jīng)元細(xì)胞減少；銀杏葉片組次之,烏龍丹低劑量組仍見神經(jīng)元細(xì)胞損傷,胞漿內(nèi)虎斑減少,尼氏小體含量降低。
　　 5.7大鼠皮層及海馬NR1、NR2B的表達(dá)
　　 NR1在各組大鼠皮層及海馬的表達(dá)水平的比值經(jīng)One-way ANOVA分析組間

17、有顯著性差異(F=466.237,P=0.000；F/Welch=718.233,P=0.000)；NR2B在各組大鼠皮層及海馬的表達(dá)水平的比值經(jīng)One-way ANOVA分析組間也有顯著性差異(F/Welch=591.984,P=0.000；F=398.379,P=0.000),需經(jīng)一步兩兩比較(采用LSD法)。結(jié)果:模型組皮層及海馬NR1、NR2B表達(dá)水平與假手術(shù)組比較,比值顯著降低(P<0.001)。烏龍丹高劑量組和銀杏葉組皮層及

18、海馬與模型組比較NR1、NR2B表達(dá)均增高(P<0.001)；但與假手術(shù)組比較,NR1、NR2B表達(dá)水平比值降低,差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。烏龍丹高劑量組與銀杏葉組比較,皮層及海馬NR1、NR2B表達(dá)水平比值也增高(P<0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.烏龍丹能改善慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 2.烏龍丹改善慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能途徑之一:增加大鼠腦皮層血流。<