烏龍丹對慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響.pdf

1、研究背景：
　　 隨著人口老齡化程度的加劇,腦血管疾病已成為一個倍受社會關(guān)注的問題。慢性腦缺血是腦血管疾病主要病理基礎(chǔ),嚴重危害人類的健康。據(jù)統(tǒng)計中老年人群中有2/3的人患有慢性腦供血不足,屬中老年人多發(fā)病。慢性腦缺血是腦灌流動脈狹窄或閉塞所引起的一種很常見的缺血性腦血管疾病。臨床表現(xiàn)主要為頭暈、頭痛、失眠、肢體麻木、記憶力減退、情緒低落等,反復(fù)發(fā)作,時輕時重、無神經(jīng)系統(tǒng)局灶性定位體征為其主要特點。
　　 針對慢性腦缺血

2、最明顯的早發(fā)癥狀之一是學(xué)習(xí)記憶減退,目前大量實驗研究主要集中在模型動物的行為學(xué),皮質(zhì)、海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)、神經(jīng)生化學(xué)、腦血流等指標的研究領(lǐng)域上。各種慢性腦缺血模型用迷宮試驗研究大鼠的行為學(xué)改變,提示慢性腦缺血損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。海馬是哺乳動物完成學(xué)習(xí)和記憶活動的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),海馬也是腦缺血最敏感的區(qū)域,是腦內(nèi)參與記憶儲存功能的重要部分。谷氨酸在學(xué)習(xí)和記憶及神經(jīng)元可塑件方面均起重要作用,N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-Methyl-D-as

3、partate receptor,NMDAR)是谷氨酸的配基和電壓雙門控離子通道,主要分布在突觸后膜；它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有特殊的雙面性,生理上與學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān)。NR2B亞基被命名為“聰明基因”,提出該基因就是記憶基因的論斷。
　　 中醫(yī)學(xué)沒有慢性腦供血不足病名,但“眩暈”、“頭痛”、“失眠”、“健忘”等歸屬此病。歷代醫(yī)家有“無虛不作?！薄ⅰ盁o瘀不作?！敝f。其病位在腦,以虛為本,由于病程遷延,往往多因兼見,虛實并存?！盀?/p>

4、龍丹”系國家級名老中醫(yī)臧堃堂教授臨床經(jīng)驗方,該方以補腎填精,健脾化痰,活血通絡(luò)立法:在臨床上常用于治療缺血性腦病,效果顯著。我們課題組早期的實驗研究表明,“烏龍丹”有多方面的藥理作用,能從不同途徑改善腦缺血后的病理變化；并能改善多發(fā)性腦梗塞癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的功能,但針對烏龍丹防治慢性腦供血不足致學(xué)習(xí)記憶減退的作用及其機理尚未進行研究。
　　 目的：
　　 本研究通過復(fù)制慢性腦缺血模型,探討慢性腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能的變化及

5、“烏龍丹”的作用,揭示慢性腦缺血與認知障礙的關(guān)系,為“烏龍丹”臨床防治慢性腦供血不足及相關(guān)疾病提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、受試藥物
　　 烏龍丹
　　 2、動物模型制作及分組
　　 采用永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈制作慢性腦缺血大鼠模型。假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動脈,不結(jié)扎,其余處理同手術(shù)組。大鼠造模后3周,存活大鼠采用隨機數(shù)字表法分組。實驗5組,每組17只,分別是假手術(shù)組、模型組、烏龍丹

6、高劑量組、烏龍丹低劑量組、銀杏葉組。烏龍丹高劑量組(相當(dāng)于生藥量8.8g/kg.d)、烏龍丹低劑量組(相當(dāng)于生藥量4.4 g/kg.d)、銀杏葉組(約含總黃酮醇苷460 mg/kg.d),假手術(shù)組和模型組灌服等量生理鹽水。每日灌胃1次,連續(xù)5周。
　　 3、觀察指標:
　　 3.1大鼠Morris水迷宮定向航行實驗搜索策略的變化
　　 3.2大鼠Morris水迷宮定向航行實驗逃避潛伏期的觀測
　　 3.3

7、大鼠Morris水迷宮空間搜索能力的變化
　　 3.4大鼠避暗實驗潛伏期時間和錯誤次數(shù)觀測
　　 3.5大鼠皮層血流量的測定
　　 3.6大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)觀察及CA1區(qū)神經(jīng)元密度比較
　　 3.7 NR1/NR2B在大鼠海馬及皮層中的表達
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,結(jié)果比較運用重復(fù)測量方差分析,單因素方差分析

8、(One-way ANOVA),組間多重比較方差齊時用LSD方法,不齊時用Dunnett's T3。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5.結(jié)果:
　　 5.1烏龍丹對慢性腦缺血大鼠Morris水迷宮定向航行實驗搜索策略的影響
　　 在最初的訓(xùn)練中,大鼠尋找平臺的搜索策略主要是邊緣式和隨機式；隨著訓(xùn)練次數(shù)增加除模型組動物仍有大部分保持此搜索策略外,假手術(shù)、銀杏葉組及烏龍丹高、低劑量組均主要以直線式和趨向式。<

9、br>　　 5.2烏龍丹對慢性腦缺血大鼠Morris水迷宮定向航行實驗逃避潛伏期的影響
　　 各組大鼠在5 d訓(xùn)練過程中尋找平臺潛伏期,隨著訓(xùn)練時間增加,潛伏期越來越短,表明大鼠在訓(xùn)練過程中已逐漸學(xué)會尋找平臺。采用重復(fù)測量和單因素方差分析,時間點和組別之間有交互效應(yīng)(F=2.096,P=0.031)；組別之間有主效應(yīng)(F=7.403,P=0.000)；各時間點間有主效應(yīng)(F=906.786,P=0.000),需進行兩兩比較。結(jié)

10、果表明,與模型組比較,烏龍丹高、低劑量組和銀杏葉組均能縮短潛伏期時間,且第3天～5天潛伏期時間有顯著性意義(P<0.05)。
　　 5.3烏龍丹對慢性腦缺血大鼠Morris水迷宮空間搜索能力的影響
　　 各組大鼠在原平臺停留時間經(jīng)One-way ANOVA分析組間有顯著性差異(F=7.245,P=0.000)；各組大鼠穿越原平臺象限路程經(jīng)One-way ANOVA分析組間也有顯著性差異(F=11.635,P=0.000)

11、；需進一步兩兩比較。結(jié)果:假手術(shù)組、烏龍丹高、低劑量組及銀杏葉組在原平臺象限停留時間和穿越原平臺象限路程均多于模型組(P<0.01)。假手術(shù)組與烏龍丹低劑量組和銀杏葉組比較,原平臺象限停留時間增多、穿越原平臺路程增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),但與烏龍丹高劑量組比較,無明顯差異(P=0.112)。
　　 5.4大鼠避暗實驗
　　 各組大鼠潛伏期時間經(jīng)One-way ANOVA分析組間有顯著性差異(F=6.858

12、,P=0.000)；各組大鼠錯誤次數(shù)經(jīng)One-way ANOVA分析組間也有顯著性差異(F=24.795,P=0.000)；需進一步兩兩比較。結(jié)果:模型組與假手術(shù)組比較,潛伏期明顯縮短(P<0.01),錯誤次數(shù)明顯增加(P<0.01)；銀杏葉組和烏龍丹高、低劑量組與模型組比較差異顯著(P<0.01),潛伏期延長,錯誤次數(shù)減少。
　　 5.5大鼠皮層血流量的測定
　　 各組大鼠皮層血流量數(shù)據(jù)經(jīng)One-way ANOVA分析

13、組間有顯著性差異(F/welch=19.384,P=0.000),需進一步兩兩比較(采用LSD法)。結(jié)果:假手術(shù)組、烏龍丹高、低劑量組及銀杏葉組的大鼠皮層rCBF均高于模型組,差異具有顯著性(P<0.01)；但烏龍丹高、低劑量組及銀杏葉組的大鼠皮層血流均低于假手術(shù)組,差異也具有顯著性(P<0.01)。
　　 5.6腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元組織病理形態(tài)學(xué)觀察
　　 HE染色后假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則,層次豐富

14、,神經(jīng)元細胞排列整齊密集、細胞間隙正常,細胞輪廓清楚,核居中,細胞突起清晰可見；模型組大鼠海馬CA1區(qū)細胞層數(shù)不完整,神經(jīng)元排列紊亂、松散,細胞間隙明顯,核固縮過半,細胞間隙水腫,可見明顯凝固性壞死和細胞脫失；烏龍丹高劑量組海馬CA1區(qū)與假手術(shù)組比較,除外層神經(jīng)元細胞有部分脫失和核固縮外,其余無明顯差異；烏龍丹低劑量組和銀杏葉片組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)介于烏龍丹高劑量組和模型組之間,可明顯減輕模型組海馬神經(jīng)元細胞脫失現(xiàn)象。
　　

15、 神經(jīng)元密度觀察:各組大鼠神經(jīng)元密度數(shù)據(jù)經(jīng)One-way ANOVA分析組間有顯著性差異(F=160.545,P=0.001),需經(jīng)一步兩兩比較(采用LSD法)。結(jié)果:各組與模型組比較,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度均大于模型組(P<0.001),而各組和假手術(shù)組比較也存在顯著差異(P<0.001)。
　　 尼氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列整齊規(guī)則,胞漿染色清晰且虎斑豐富,胞核淡染；但模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元

16、細胞排列散亂,神經(jīng)元胞體腫脹,核固縮、凝聚,胞漿內(nèi)虎斑明顯減少,提示尼氏小體大量溶解；各給藥組神經(jīng)元病變均輕于模型組,可見部分神經(jīng)元細胞和尼氏小體減少,烏龍丹高劑量組改善最為明顯,僅有少量神經(jīng)元細胞減少；銀杏葉片組次之,烏龍丹低劑量組仍見神經(jīng)元細胞損傷,胞漿內(nèi)虎斑減少,尼氏小體含量降低。
　　 5.7大鼠皮層及海馬NR1、NR2B的表達
　　 NR1在各組大鼠皮層及海馬的表達水平的比值經(jīng)One-way ANOVA分析組間

17、有顯著性差異(F=466.237,P=0.000；F/Welch=718.233,P=0.000)；NR2B在各組大鼠皮層及海馬的表達水平的比值經(jīng)One-way ANOVA分析組間也有顯著性差異(F/Welch=591.984,P=0.000；F=398.379,P=0.000),需經(jīng)一步兩兩比較(采用LSD法)。結(jié)果:模型組皮層及海馬NR1、NR2B表達水平與假手術(shù)組比較,比值顯著降低(P<0.001)。烏龍丹高劑量組和銀杏葉組皮層及

18、海馬與模型組比較NR1、NR2B表達均增高(P<0.001)；但與假手術(shù)組比較,NR1、NR2B表達水平比值降低,差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。烏龍丹高劑量組與銀杏葉組比較,皮層及海馬NR1、NR2B表達水平比值也增高(P<0.001),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.烏龍丹能改善慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 2.烏龍丹改善慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能途徑之一:增加大鼠腦皮層血流。<