擬南芥中兩種動蛋白異型體KatB-KatC生化性質(zhì)及組織分布研究.pdf

1、動蛋白是一類依賴于微管的馬達蛋白，它能利用ATP水解產(chǎn)生的能量沿微管運動。動蛋白具有依賴于核苷酸的微管結(jié)合特性和被微管激活的ATPase特性，這兩個特性由動蛋白的頭部馬達區(qū)負責。動蛋白組成一個龐大的動蛋白超家族，廣泛存在真核細胞，參與了眾多的生物學過程，如細胞器運輸、有絲分裂和減數(shù)分裂、微管的動態(tài)調(diào)節(jié)以及信號轉(zhuǎn)導等。擬南芥中存在著61個動蛋白異型體。KatB和KatC是于1993年從擬南芥中最早克隆出的五個動蛋白基因中的兩個，屬于C端馬

2、達蛋白，它們所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸同源性高達84％。雖然其基因很早就被克隆，但有關二者的生物化學特性和功能報道很少。深入研究KatB和KatC的體外生物化學特性和體內(nèi)組織分布規(guī)律，對揭示植物動蛋白異型體的功能作用具有重要的理論意義。 本研究利用KatC的N-端尾部區(qū)域(128aa)的cDNA序列構(gòu)建了原核表達載體，并在大腸桿菌中進行表達、純化。與微管的共沉淀實驗表明，KatCN-端尾部區(qū)域能與微管結(jié)合，而且這種結(jié)合不依賴于ATP。

3、冷CCD熒光顯微觀察結(jié)果表明，KatCN-端尾部區(qū)域不能引起微管的成束。為了確定負責與微管結(jié)合的最小區(qū)域，構(gòu)建了6段不同長度的原核表達載體，并進行了表達、純化；純化的各刪除片段用來與微管進行共沉淀分析。結(jié)果表明，KatCN端尾部區(qū)域的第74-86aa肽段是負責與微管結(jié)合的區(qū)域，而且包含此區(qū)域的不同刪除片段與微管的結(jié)合比不同，說明這一微管結(jié)合位點可能是構(gòu)象依賴型的。點突變實驗結(jié)果進一步表明，Arg77和Arg79在KatC的N-端尾部區(qū)域

4、與微管結(jié)合的過程中起著關鍵性的作用。同時構(gòu)建、表達、純化了KatB的除去馬達區(qū)的385個氨基酸的片段，其與微管的共沉淀實驗表明，KatB在尾部區(qū)域同樣也存在著第二個微管結(jié)合位點。 將含有KatB、KatC桿區(qū)的KatB和KatC區(qū)段分別融合His、GST，各產(chǎn)生了兩種帶不同標簽的融合蛋白，通過Pulldown實驗研究KatB、KatC各自及二者的相互作用。實驗結(jié)果表明，KatB、KatC不但各自可以自己相互作用，形成同源二聚體，

5、二者也可以相互作用形成異源二聚體。 用gus作為報告基因，對KatB和KatC啟動子驅(qū)動的gus活性進行比較。結(jié)果表明：(1)KatB和KatC啟動子在根部都有活性，但具體部位不同。KatC啟動子的活性主要集中在根尖分生區(qū)及幼嫩的根毛中。而KatB啟動子除了在分生區(qū)有活性外，在中柱內(nèi)及不同發(fā)育時期的側(cè)根內(nèi)都有較強的活性。(2)KatB啟動子驅(qū)動的gus在葉原基、葉脈、葉毛、花藥、果莢中都有活性，但KatC啟動子驅(qū)動的gus卻只在

6、果莢中有活性。 為了進—步了解KatB、KatC在植物體內(nèi)的分布，分別選用KatB特異肽段及KatC的特異肽段為抗原，制備抗血清。經(jīng)親和純化的抗體能夠特異地識別KatB、KatC而無免疫交叉反應。用免疫印跡對KatB、KatC在擬南芥中的組織分布進行了研究，結(jié)果表明：KatB在擬南芥中，除了果莢外，在幼苗、根、莖、葉和花中都有表達，但KatC在葉和花中表達很弱，卻在果英里表達較強。 為了了解KatB、KatC在植物體內(nèi)的