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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):采用固定化金屬螫合親和層析(ImmobilizedMetalAffinityChromatography,IMAC),從血漿蛋白分離Cohn氏法組分Ⅳ(CohnFractionⅣ,CFⅣ)純化蛋白C(ProteinC,PC)過(guò)程中,以咪唑(Imidazole)緩沖液進(jìn)行階段洗脫時(shí),在低濃度(0.008mol/L)和高濃度(0.040mol/L)的咪唑緩沖液作用下,蛋白洗脫峰分別具有較高的PC抗原性和PC活性,
2、而在中間濃度(0.015mol/L)的咪唑緩沖液作用下,蛋白洗脫峰雖具有較高的PC抗原性,但PC活性較低。從該現(xiàn)象推測(cè),CFⅣ中可能含有性質(zhì)差異較大的PC活性成分,這在國(guó)內(nèi)外未曾見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探明其原因,為PC制品的制備和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
方法:(1)用離子交換層析初步純化CFⅣ中的PC后,①重復(fù)原來(lái)的IMAC實(shí)驗(yàn);②設(shè)計(jì)新的IMAC洗脫方案:采用0.008mol/L、0.040mol/L、0.150mol/L和0.
3、300mol/L的咪唑洗脫濃度。
(2)用發(fā)色底物法檢測(cè)PC活性。
(3)用WesternBlot方法證明PC特異性。
(4)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CapillaryZoneElectrophrosis,CZE)分析前后兩種IMAC洗脫方案中的各洗脫峰。
(5)用免疫親和層析(ImmuneAffinityChromatography,IAC)純化IMAC中PC差異顯著的洗脫峰。
4、 (6)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù)分析PC差異成分,獲得質(zhì)譜圖,并從生物信息學(xué)角度分析原因。
結(jié)果:(1)PC活性檢測(cè)顯示:①原來(lái)的IMAC實(shí)驗(yàn)中,0.008mol/L、0.015mol/L、0.040mol/L咪唑緩沖液洗脫的PC活性分別為(75.941±3.010)%、(5.592±1.410)%、(42.334±2.821)%;0.015mol/L咪唑緩沖液洗脫的PC活性與0.008mo
5、l/L和0.040mol/L咪唑緩沖液洗脫的PC活性進(jìn)行t檢驗(yàn),P值均小于0.05,有顯著性差異。②新的IMAC洗脫方案中,0.008mol/L、0.040mol/L、0.150mol/L和0.300mol/L的咪唑緩沖液洗脫的PC活性分別為(73.411±2.076)%、(54.694±1.692)%、(31.610±1.118)%和(30.557±2.553)%;0.015mol/L咪唑緩沖液洗脫的PC活性與0.300mol/L的咪
6、唑緩沖液洗脫的PC活性進(jìn)行t檢驗(yàn),P值小于0.05,有顯著性差異。
(2)WesternBlot結(jié)果顯示:①用0.015mol/L咪唑緩沖液洗脫的蛋白洗脫峰僅在52KDa處有一條蛋白曝光帶(smallPC,sPC);其他濃度的咪唑緩沖液洗脫的蛋白洗脫峰在62KDa處有一條蛋白曝光帶(bigPC,bPC);②在110KDa處,CFIV來(lái)源的所有樣品都有一條蛋白曝光帶。
(3)CZE結(jié)果顯示:0.015mol/L
7、咪唑緩沖液洗脫液中的PC在遷移時(shí)間為(10.467±0.016)min和(11.333±0.009)min時(shí)出峰,在(10.667±0.024)min和(16.167±0.012)min時(shí)不出峰。0.300mol/L咪唑緩沖液洗脫液中的PC的在上述遷移時(shí)間的出峰情況與前者相反。
(4)0.015mol/L咪唑緩沖液洗物經(jīng)IAC純化,得到以sPC為主要成分的濃縮物,PC活性為(41.903±1.900)%;0.300mol/
8、L咪唑緩沖液洗脫物經(jīng)IAC純化,得到以bPC為主要成分的濃縮物,PC活性為(1238.523±3.996)%。兩樣品PC活性進(jìn)行t檢驗(yàn),P值小于0.05,具有顯著性差異。
(5)HPLC-MS/MS顯示:0.015mol/L咪唑緩沖液洗脫物經(jīng)IAC純化后的樣品為PC,Mascot積分為379;0.300mol/L咪唑緩沖液洗脫物經(jīng)IAC純化后的樣品同樣為PC,Mascot積分為809。
(6)生物信息學(xué)結(jié)果顯
9、示:①sPC與bPC的PC匹配肽相比較,有4個(gè)相同肽段、1個(gè)較短肽段和3個(gè)缺失肽段;110KDa對(duì)曝光的蛋白條帶具有6個(gè)PC匹配肽。②sPC的PC匹配肽中含有3個(gè)組氨酸和4個(gè)色氨酸,bPC的PC匹配肽中分別含有6個(gè)組氨酸和6個(gè)色氨酸。
結(jié)論:(1)CFⅣ中存在活性差異較大的兩種PC成分。大分子量的bPC活性高,小分子量的sPC活性低。
(2)sPC與bPC中肽段的差異,是兩種PC成分具有不同活性的原因。
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