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文檔簡介
1、大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)分布于我國東南沿海潮間灘涂,生活于洞穴之中,因其肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,是我國東南沿海的重要的養(yǎng)殖魚類之一。前期的研究發(fā)現(xiàn),生殖季節(jié)雄性大彈涂魚在洞穴中建造產(chǎn)卵室,性成熟的雌雄魚在產(chǎn)卵室內(nèi)交配產(chǎn)卵,受精卵粘附在產(chǎn)卵室的頂部和四周,仔魚需要5d才能孵出。雖然洞穴內(nèi)底泥和海水含有許多致病菌,但大彈涂魚受精卵在孵化期間卵膜和胚體始終保持清潔透明狀態(tài),孵化率達到99.7%。為了了
2、解大彈涂魚在生殖過程中的免疫抗菌機制,本文采用了分子生物學等方法克隆了大彈涂魚兩種Hepcidin基因亞型(Hepcidin-1和Hepcidin-2),并研究了其在大彈涂魚不同組織中的表達、不同實驗條件下的表達變化、生殖前期和生殖高峰期時不同的表達情況以及Hepcidin-2在精巢和貯精囊中的細胞定位。主要結(jié)果如下:
1.Hepcidin-1基因的部分片段長412bp,其中開放閱讀框長267bp,編碼一個由88個氨基酸組成的
3、多肽片段。Hepcidin-2基因的部分片段長345bp,其中開放閱讀框長267bp,編碼一個由88個氨基酸組成的多肽片段。
2.蛋白質(zhì)比對分析發(fā)現(xiàn),大彈涂魚的兩種Hepcidin多肽結(jié)構(gòu)與其他硬骨魚類中的Hepcidin的結(jié)構(gòu)相似,有8個高度保守的半胱氨酸殘基,由這些半胱氨酸殘基在成熟肽中形成的二硫鍵維持著多肽反向平行β-折疊的二級結(jié)構(gòu)。大彈涂魚多肽序列的N端有一個推測與鐵離子調(diào)控相關(guān)的氨基酸殘基序列:Q-S/I-H-L/I
4、-S/A,Hepcidin-2中沒有此序列。用部分已知的脊椎動物Hepcidin蛋白序列建樹分析發(fā)現(xiàn),大彈涂魚Hepcidin-1和Hepcidin-2分別屬于HAMP1和HAMP2亞型。
3.實時熒光定量方法分析結(jié)果顯示,Hepcidin-1主要分布于大彈涂魚的肝臟組織中;而Hepcidin-2分布相對廣泛,除了在肝臟中表達量較高之外,在脾和精巢中也有較高的表達。
4.以LPS(lipopolysaccharid,
5、脂多糖)和Dextran-iron注射大彈涂魚,研究兩種Hepcidin基因在雄魚性腺中的表達變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射LPS后6h,精巢和貯精囊組織中Hepcidin-1的表達量都顯著上調(diào),而Hepcidin-2在這兩個組織中則是從3h開始一直到24h都顯著高于對照組;注射Dextran-iron24h之后只有在肝臟中Hepcidin-1才有顯著的上調(diào)。
5.熒光定量分析發(fā)現(xiàn),Hepcidin-1在生殖高峰期(5-6月)的表達量
6、在精巢組織中沒有顯著變化,而在生殖前期(3月)的表達量在貯精囊中有顯著的上調(diào)。Hepcidin-2無論是在精巢還是在貯精囊中,從1月到6月呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢,在生殖高峰期達到最高,說明生殖季節(jié)Hepcidin-2基因在大彈涂魚雄魚性腺中可能起到了重要的免疫作用。
6.為了了解Hepcidin-2與性腺發(fā)育的關(guān)系,使用催產(chǎn)素LHRH-A3在非生殖期(11月)注射大彈涂魚。結(jié)果表明,注射后24h貯精囊和精巢之中Hepcidin-
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