兩種硬蜱雄性性腺功能因子的研究.pdf

1、交配是蜱類繁殖過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),誘發(fā)雌蜱發(fā)生一系列的生理變化,并最終產(chǎn)卵。雄蜱性腺分泌物在交配過程中發(fā)揮著十分重要的作用,一方面保護(hù)、活化精子,促進(jìn)授精,刺激卵巢發(fā)育和卵黃發(fā)生,另一方面對雌蜱的生理行為等產(chǎn)生影響,如誘導(dǎo)雌蜱快速吸血,加速產(chǎn)卵等。本文的綜述部分在簡要描述雄蜱性腺形態(tài)結(jié)構(gòu)和分泌物生化特性基礎(chǔ)上,系統(tǒng)闡述了雄蜱性腺分泌物中各種功能因子的研究現(xiàn)狀,著重論述其在精子獲能、誘導(dǎo)雌蜱吸血、促進(jìn)雌蜱卵巢發(fā)育和卵黃發(fā)生方面的進(jìn)展,并對未

2、來的研究提出了展望,以期為今后此領(lǐng)域研究開拓思路,促進(jìn)防治工作的開展。
　　 本研究以河北省廣泛分布的兩種硬蜱—長角血蜱和森林革蜱為研究對象。利用體腔注射、酶聯(lián)免疫分析對飽血雄蜱性腺分泌物的功能活性進(jìn)行了研究；利用cDNA文庫構(gòu)建、cDNA末端快速擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時定量PCR技術(shù)擴(kuò)增得到飽血因子的全長序列并對其階段和組織表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)分析；利用液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對長角血蜱飽血雄蜱性腺蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析。以上工作為進(jìn)一步

3、探索蜱類引發(fā)雌蜱交配效應(yīng)的功能物質(zhì)以及利用它們開發(fā)抗蜱疫苗奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步加深對蜱類飽血因子的了解,并為蜱類飽血因子序列保守性研究提供基礎(chǔ),同樣采用cDNA文庫構(gòu)建和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增得到了森林革蜱飽血因子的全長序列。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)
　　 (1)飽血雄蜱性腺提取液具有刺激處于緩慢吸血期未交配雌蜱進(jìn)入快速吸血期,從而快速飽血脫落的

4、功能,表現(xiàn)在飽血時間短,飽血率高,對飽血體重方面影響顯著。
　　 (2)飽血雄蜱性腺提取液具有促進(jìn)卵巢發(fā)育,促進(jìn)外周脂肪體合成卵黃原蛋白,促進(jìn)卵巢攝取卵黃蛋白的功能。
　　 (3)不同注射劑量的飽血雄蜱性腺提取液在雌蜱的飽血體重,卵巢重量,外周脂肪體合成卵黃原蛋白,卵巢攝取卵黃蛋白方面無明顯差異。僅高劑量實(shí)驗(yàn)組在飽血體重和卵黃原蛋白兩方面有差異。
　　 (4)根據(jù)體腔注射飽血雄蜱性腺提取液得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常交配

5、相類似,而在交配中雄蜱的交配功能物質(zhì)進(jìn)入的是雌蜱生殖道,本實(shí)驗(yàn)中提取液進(jìn)入的是雌蜱的血淋巴,因此推斷雄蜱交配功能物質(zhì)在雌蜱體內(nèi)的運(yùn)輸循環(huán)途徑是隨精液進(jìn)入雌蜱生殖道后透過生殖道管壁,進(jìn)入血淋巴中,通過血淋巴的循環(huán)到達(dá)靶組織,發(fā)揮功能。
　　 (5)成功構(gòu)建高質(zhì)量的飽血雄蜱性腺cDNA文庫,初級文庫庫容量是1.71×106,擴(kuò)增文庫的庫容是2.8×108。
　　 (6)成功擴(kuò)增得到飽血因子HIEFα的全長序列(HQ90809

6、0),全長647 bp,開放式閱讀框起始于116位終止于572位,共編碼152個氨基酸。
　　 (7)發(fā)育10天后的卵,處于饑餓期的幼蜱、若蜱、雌蜱、雄蜱均不表達(dá)HIEFα,吸血96h的未交配雌蜱各組織均檢測不到H1EFα。交配前后雌蜱卵巢的H1EFα含量變化不大。
　　 (8)吸血或者雄蜱性腺發(fā)育成熟是H1EFα合成的必要條件(饑餓期無,飽血后有),推斷合成部位是雄蜱的精巢／輸精管。
　　 (9)對cDNA文庫

7、進(jìn)行隨機(jī)篩選得到雄蜱飽血性腺的一些基因序列。
　　 (10)對飽血雄蜱性腺總蛋白進(jìn)行LC-MS分析,經(jīng)比對得到此時期此組織部分蛋白組成,建議以后的實(shí)驗(yàn)采用雙向電泳進(jìn)行初步分離后再進(jìn)行LC-MS分析。
　　 2.森林革蜱(Dermacentor silvarum)
　　 (1)成功構(gòu)建高質(zhì)量的飽血雄蜱性腺cDNA文庫,初級文庫庫容量是2.17×106,擴(kuò)增文庫的庫容是3.5×108。
　　 (2)成功擴(kuò)增得

8、到飽血因子DsEFα的全長序列(HQ908089),全長672 bp,開放式閱讀框起始于127位終止于580位,共編碼151個氨基酸。
　　 (3)對cDNA文庫進(jìn)行隨機(jī)篩選得到雄蜱飽血性腺的一些基因序列。
　　 (4)對目前已知的長角血蜱、森林革蜱、具尾扇頭蜱(Rhipicephalus appendiculatus)、希伯來花蜱(Amblyomma hebraeum)、變異革蜱(Dermacentor variabi