微流控芯片Edman降解及在蛋白質(zhì)測(cè)序中的應(yīng)用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),即蛋白質(zhì)內(nèi)氨基酸的排列順序是蛋白質(zhì)科學(xué)研究的前提,獲得該信息是一直是生命科學(xué)最重要研究?jī)?nèi)容之一,具有相當(dāng)重要的意義。然而當(dāng)前蛋白質(zhì)序列測(cè)定的質(zhì)譜法和Edman降解法都存在著不足之處。前者的局限在于準(zhǔn)確度不高,會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤、假陽(yáng)性的結(jié)果：后者靈敏度過(guò)低,需要樣品量多,難于應(yīng)用于同疾病相關(guān)的低豐度蛋白質(zhì)序列測(cè)定。本文首次研究在微流控芯片內(nèi)完成Edman降解,大幅度提高了Edman降解法測(cè)序的靈敏度,并且通過(guò)同MS技術(shù)聯(lián)用,提

2、高痕量蛋白質(zhì)序列鑒定的準(zhǔn)確度。 笫一章綜述了蛋白質(zhì)一級(jí)序列測(cè)定進(jìn)展。 第二章研制了體積僅為3.5 nL、可以重復(fù)使用的微流控芯片C18固相微萃取裝置,研究了在微流控芯片上精確控制納升級(jí)流體的方法。該C18柱可以富集痕量的多肽樣品。二維凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)酶解液通過(guò)固相微萃取脫鹽后,樣品體積由幾微升濃縮到50 nL并直接轉(zhuǎn)移至MALDI-TOF-MS靶上進(jìn)行測(cè)定。分析結(jié)果表明新的方法能夠大幅度蛋白質(zhì)測(cè)定的序列覆蓋度。

3、 第三章研究了在微流控芯片用Edman降解測(cè)定蛋白質(zhì)序列的方法和性能,并通過(guò)分子量的差別鑒定多肽的序列。采用該方法測(cè)定了亞飛摩爾級(jí)別合成多肽的序列,比經(jīng)典的Edman降解法的樣品用量降低了數(shù)百倍。與MALDI-TOF-MS相結(jié)合測(cè)定二維凝膠電泳分離后銀染蛋白質(zhì)樣品序列時(shí),原先模棱兩可的結(jié)果有了明確的歸屬。 第四章通過(guò)在微流控芯片上進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的Edman降解,準(zhǔn)確地得到多肽N端氨基酸殘基的信息,解決了MS/MS譜圖內(nèi)難以辨別

4、b/y系列離子的難題,并成功地完成了三個(gè)多肽樣品(包括一個(gè)C端修飾的神經(jīng)多肽)的從頭測(cè)序。通過(guò)兩個(gè)循環(huán)的Edman降解能夠得到多肽的N端兩個(gè)氨基酸殘基的序列,根據(jù)這些信息能夠推斷出原始多肽MS/MS譜圖中b2離子的摩爾質(zhì)量。采用b2離子作為內(nèi)標(biāo),可以提高測(cè)定MS/MS譜圖中其它碎片質(zhì)荷比的準(zhǔn)確度,從而解決了在MS/MS測(cè)定時(shí)難以用內(nèi)標(biāo)法提高測(cè)定碎片離子摩爾質(zhì)量準(zhǔn)確度的問(wèn)題。 第五章旨在提高Edman測(cè)序的自動(dòng)化程度。研究了用注射