基于微流控芯片的免疫傳感器和蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、微流控芯片已經(jīng)在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、藥物合成篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。微流控芯片結(jié)合了生物技術(shù)和微電子加工技術(shù)等,將實(shí)驗(yàn)室中多種儀器的功能集成到芯片上進(jìn)行處理,具有微型化、檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、易于集成化等優(yōu)點(diǎn)。目前普遍使用的微流控芯片的制作材料是高分子聚合材料,但是其仍存在非特異性吸附等問題。研究結(jié)果表明,對(duì)高分子材料表面進(jìn)行修飾改性可以改善它的性質(zhì),使聚合物芯片更有利于實(shí)際生物樣品分析。本論文以高分子聚合物芯

2、片為分析平臺(tái),通過有效的修飾方法對(duì)微流控芯片通道表面進(jìn)行修飾和改性,成功實(shí)現(xiàn)了芯片通道內(nèi)生物分子的固定,為生物分析提供了新的研究方法。
　　論文的第一章綜述了微流控芯片加工方法、制作材料、檢測(cè)技術(shù)和實(shí)際應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展,并強(qiáng)調(diào)了對(duì)微流控芯片通道表面進(jìn)行改性和修飾的必要性和重要性;同時(shí),詳細(xì)介紹了免疫分析、生物傳感器和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展?fàn)顩r、主要研究?jī)?nèi)容和應(yīng)用領(lǐng)域;最后總結(jié)了本論文研究的目的和意義。
　　本論文研究工作分為三

3、章,以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)微流控芯片作為研究對(duì)象,分別采用不同的表面修飾方法,包括聚乙烯亞胺衍生法、納米金膠層層組裝法、氧化鋁溶膠-凝膠法,將S100B蛋白抗體、核酸適配體和胰蛋白酶有效地固定在微流控芯片通道表面,發(fā)展了以微流控芯片為技術(shù)平臺(tái)的酶聯(lián)免疫分析、核酸適配體特異識(shí)別蛋白定量分析以及酶反應(yīng)器用于蛋白鑒定的新方法。具體內(nèi)容如下:
　　一、基于核酸適配體的微流控芯片用于生物傳感器的分析研

4、究
　　本工作將核酸適配體(aptamer)固定在納米金顆粒修飾的PMMA微流控芯片通道的內(nèi)表面,利用篩選出來的核酸適配體能夠高度特異性地識(shí)別人凝血酶蛋白的特點(diǎn),進(jìn)而將凝血酶蛋白捕獲在芯片表面,同時(shí)凝血酶蛋白再與標(biāo)記有生物素的二級(jí)核酸適配體相結(jié)合,最后利用生物素-親和素特異性相互作用的性質(zhì),將堿性磷酸酶固定,堿性磷酸酶可以催化底物產(chǎn)生靈敏的電化學(xué)信號(hào),從而達(dá)到檢測(cè)人凝血酶蛋白的目的。本方法同時(shí)結(jié)合了微流控芯片反應(yīng)速度快、耗樣量少、

5、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),最后測(cè)得的人凝血酶蛋白的檢出限可以達(dá)到1pM,線性范圍寬,從1pM～100pM,將該方法用于實(shí)際人血清樣品中凝血酶蛋白的檢測(cè),結(jié)果令人滿意。
　　二、微流控芯片用于腦損傷標(biāo)志物S100B蛋白的高靈敏度分析檢測(cè)
　　在本工作中,我們發(fā)展了一種基于微流控芯片的電化學(xué)免疫傳感器用于低濃度的腦損傷標(biāo)志物S100B的分析檢測(cè)。利用聚乙烯亞胺(PEI)對(duì)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片通道表面進(jìn)行氨基化修飾,用于S100

6、B蛋白抗體的固定。PEI是一種具有豐富氨基官能團(tuán)的高分子聚合物,它能夠覆蓋在PMMA表面引入氨基官能團(tuán),因此被廣泛用于蛋白質(zhì)和DNA的固定。S100B蛋白抗體固定后,通過抗原一抗體特異性反應(yīng),將S100B蛋白和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗依次結(jié)合在一起,形成了微流控芯片通道內(nèi)的具有三明治夾心結(jié)構(gòu)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)體系。在芯片微通道的末端,利用三電極電化學(xué)檢測(cè)體系記錄下用堿性磷酸酶催化4-氨基苯基磷酸鹽(PAPP)時(shí)產(chǎn)生的還原電流信號(hào),從而檢測(cè)S10

7、0B蛋白的濃度,檢出限低至0.1pgmL-1,線性范圍為0.1pgml-1～100pgmL-1。整個(gè)溫育反應(yīng)過程和檢測(cè)過程被集成在微芯片裝置上,具有高靈敏度、特異性和分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。因此,該方法為臨床免疫檢驗(yàn)提供了一種新的多功能的檢測(cè)平臺(tái)。
　　三、氧化鋁溶膠.凝膠修飾微流控芯片酶反應(yīng)器用于低豐度蛋白的酶解鑒定
　　本工作通過材料表面酯鍵的水解作用,產(chǎn)生-OH、-COOH等活性基團(tuán),進(jìn)一步通過它們和溶膠一凝膠縮合反應(yīng),在聚

8、對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)芯片通道內(nèi)部構(gòu)建了溶膠-凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶的包埋固定,制備了Al2O3溶膠-凝膠修飾的PET芯片酶反應(yīng)器,用于低豐度蛋白的檢測(cè)。Al2O3溶膠-凝膠固定在PET微流控芯片的通道表面,提供了一個(gè)具有親水性和生物相容性的界面,用于胰蛋白酶的包埋固定。由于將大量的胰蛋白酶限定在了狹小的微通道中,痕量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白在幾秒內(nèi)可以在芯片酶反應(yīng)器上完成酶解步驟。我們從鼠肝細(xì)胞中提取的復(fù)雜樣品來評(píng)估Al2O3溶膠.凝膠