人CuZn-SOD突變基因在聚球藻中的高效表達(dá)及活性研究.pdf

1、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一種重要的氧自由基清除劑，它催化超氧陰離子自由基(superoxide radical，O2-)的歧化反應(yīng)。O2-被認(rèn)為對(duì)各種生物大分子及其它細(xì)胞組分具有嚴(yán)重的損傷作用，SOD能預(yù)防和治療由超氧陰離子自由基引起的多種疾病如家族性肌萎縮性側(cè)索硬化(FALS)等。在臨床上，已用于一些炎癥、腫瘤、皮膚病、心血管病等疾病的治療，用于延緩衰老。在國(guó)外，已有含SOD化妝品制劑、抗輻

2、射SOD膠囊、治療局部缺血癥SOD制劑等的專利生產(chǎn)。美國(guó)、日本及西歐一些國(guó)家早已開發(fā)重組人SOD藥物，有的已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期和Ⅲ期臨床研究。因而SOD是一種很有前途的藥用酶，作為保健食品及化妝品的有效成分亦有廣泛的應(yīng)用前景，但SOD在體內(nèi)的穩(wěn)定性比較差、半衰期比較短，從而使其功能的發(fā)揮受到一定的限制。 本研究分別構(gòu)建人銅鋅超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)和突變hCuZn-SOD表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)，測(cè)定兩種hCuZn-SOD

3、在不同溫度及pH條件下的酶活力。結(jié)果表明，兩種重組蛋白主要以包涵體形式存在，表達(dá)量都占菌體總蛋白的45％以上，突變hCuZn-SOD酶活力高于hCuZn-SOD，且突變hCuZn-SOD穩(wěn)定性高于hCuZn-SOD，提示從基因突變的角度改善酶的性能的嘗試是有益的。然后根據(jù)文獻(xiàn)提供的序列，設(shè)計(jì)引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到藻藍(lán)蛋白cpc啟動(dòng)子，經(jīng)過(guò)測(cè)序，多步克隆，與目的基因hCuZn-SOD、rbcS polyA終止區(qū)和Km基因連接，構(gòu)建為p

4、CMSOD質(zhì)粒。然后用EcoRI和SAII對(duì)藍(lán)藻Synechoccus sp.PCC7942的總?cè)旧w進(jìn)行雙酶切，所得的隨機(jī)片段與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的表達(dá)重組質(zhì)粒pcMSOD大片段(含cpc啟動(dòng)子、hCuZn-SOD基因、rbcS polyA終止區(qū)和Kmr基因)連接，構(gòu)建成為含有藍(lán)藻染色體DNA同源片段的供體表達(dá)質(zhì)粒。利用自然轉(zhuǎn)化法將該供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主Synechoccus sp.PCC7942，通過(guò)卡那霉素篩選得到具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因

5、藻株。該藻株在BG-11培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，提示隨機(jī)整合靶位合適。以hCuZn-SOD基因片段兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物對(duì)轉(zhuǎn)化藻株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，證明目的片段已經(jīng)整合到宿主的基因組中。轉(zhuǎn)化藻通過(guò)光強(qiáng)12001x誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE，通過(guò)凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)與預(yù)期外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物hCuZn-SOD大小相當(dāng)?shù)?6KD左右的特異蛋白條帶，蛋白掃描結(jié)果顯示目的蛋白占可溶性蛋白的6.8％，通過(guò)Western-blot進(jìn)一步證實(shí)了此

6、特異蛋白的存在。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)hCuZn-SOD突變基因聚球藻可明顯提高小鼠血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活力和全血過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，顯著提高小鼠血清和肝臟中CuZn-SOD和總SOD(T-SOD)的活力，顯著降低小鼠血清和肝臟的丙二醛(MDA)含量，提示轉(zhuǎn)hCuZn-SOD突變基因聚球藻有較強(qiáng)的抗氧化作用。 本研究首先分別構(gòu)建hCuZn-SOD和突變hCuZn-SOD表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)，比較兩種表達(dá)