CCK-8對脂多糖誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞CuZn-SOD基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 內(nèi)毒素休克是嚴(yán)重危害人類健康的病理過程，死亡率極高，一直是醫(yī)學(xué)研究的重點課題。血管調(diào)節(jié)機制紊亂是內(nèi)毒素休克特征性病理改變之一，主要表現(xiàn)為內(nèi)毒素休克發(fā)生早期主動脈壓下降、肺動脈壓升高。在內(nèi)毒素休的發(fā)病過程中氧自由基(oxygen—derived free radicals，OFR)的生成增多與血管調(diào)節(jié)機制紊亂密切相關(guān)，是造成內(nèi)毒素休克患者持續(xù)性低血壓的重要原因之一。其中超氧陰離子(superoxide anion，O<'-

2、><,2>)能衍生多種其他氧化劑、啟動過氧化損傷，O<'-><,2>還可以與同時增多的一氧化氮(nitricoxide，NO)通過快速非酶促化學(xué)反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子(ONOO<'->)。ONOO<'->的反應(yīng)性極強，可與機體絕大多數(shù)成分反應(yīng)，可劑量依賴性導(dǎo)致離體胸主動脈收縮反應(yīng)進(jìn)行性低下，表明由NO和O<'-><,2>衍生的ONOO<'->可能是內(nèi)毒素休克發(fā)病過程中引起動脈反應(yīng)性異常變化的關(guān)鍵因素。 八肽膽囊收縮素(cho

3、lecystokinin octapeptide，CCK-8)是一種小分子腦腸肽，通過其受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其受體屬于G蛋白藕聯(lián)受體，根據(jù)親和力以及生物學(xué)功能的不同，分為A、B兩種亞型。CCK-8具有明確的抗內(nèi)毒素休克作用，其詳細(xì)分子作用機制尚不十分清楚。CCK-8可抑制內(nèi)毒素孵育的培養(yǎng)肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞生成ONOO<'->，而對外源性O(shè)NOO<'->沒有直接清除作用，表明CCK-8作用的靶分子可能是血管一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶

4、(superoxide dismutase，SOD)或O<'-><,2>的生成體系。本室已有研究表明CCK-8對LPS誘導(dǎo)大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞(thoracic aortic smooth muscle cells，TASMCs)SOD活性變化有調(diào)節(jié)作用，本實驗在此基礎(chǔ)上觀察CCK一8對LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究CCK-8緩解內(nèi)毒素休克血管動力學(xué)紊亂的分子機制。 方法： 選

5、用雄性、健康Wistar大鼠(120±20g)，無菌條件下分離大鼠胸主動脈，用貼塊法培養(yǎng)TASMCs，傳代至對數(shù)生長期(實驗用5～8代)，調(diào)整細(xì)胞密度為每瓶1×10<'7>，加入無血清DMEM培養(yǎng)液以及不同處理因素，分組如下： 1、LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD mRNA表達(dá)：以生理鹽水為對照組，用0.1mg/L LPS孵育細(xì)胞2h、4h和8h，0.01mg/L、0.1mg/L、Img/L LPS分別孵育細(xì)胞4h，測定

6、CuZn-SOD mRNA表達(dá)變化。 2、CCK-8對LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD mRNA表達(dá)的影響：以生理鹽水為對照組，經(jīng)10<'-8>mol/L CCK-8，0.1mg/L LPS和10<'-6>、10<'-8>、10<'-10>mol/L CCK-8+LPS分別孵育細(xì)胞4h，測定CuZn-SODmRNA表達(dá)變化。 3、CCK-8對LPS誘導(dǎo)TASMCsCuZn-SOD基因表達(dá)影響的受體機制：以生理

7、鹽水為對照組，10<'-8>mol/L CCK-8、0.1mg/L LPS、CCK-8+LPS和10<'-5>mol/L CR-1409+CCK-8+LPS、10<'-5>mol/L CR-2945+CCK-8+LPS分別分別孵育細(xì)胞4h，測定CuZn-SODmRNA表達(dá)變化，其中CR-1409、CR一2945分別為CCK-AR和CCK-BR特異性拮抗劑。用RT-PCR方法檢測CuZn-SOD基因表達(dá)，用江蘇捷達(dá)凝膠分析軟件對電泳譜帶進(jìn)

8、行半定量分析，用CuZn-SOD與β-actin的吸光度比值代表CuZn-SOD mRNA相對表達(dá)水平。數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 1、LPS對TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)的影響 (1)LPS與CuZn-SOD基因表達(dá)的時效關(guān)系對照組TASMCs存在CuZn-SO

9、D mRNA低水平表達(dá)；0.1mg/LLPS孵育細(xì)胞2h CuZn-SOD mRNA表達(dá)呈現(xiàn)增高趨勢，LPS孵育細(xì)胞4h CuZn-SOD mRNA表達(dá)增高與對照組相比有明顯差異(P<0.01)，LPS孵育細(xì)胞8h CuZn-SODmRNA持續(xù)高表達(dá)(P<0.05)。(2)LPS與CuZn-SOD基因表達(dá)的量效關(guān)系對照組TASMCs存在CuZn-SODmRNA低水平表達(dá)；0.01 mg/L、0.1 mg/L及1mg/L LPS孵育細(xì)胞4

10、h CuZn-SOD mRNA表達(dá)均增高，0.1mg/L LPS組與對照組相比有明顯差異(P<0.01)，lmg/L LPS組CuZn-SOD mRNA持續(xù)高表達(dá)(P<0.05)。 2、CCK-8對LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD mRNA表達(dá)的影響CCK-8預(yù)先處理TASMCs 30 min后再加入LPS，則LPS對TASMCs CuZn-SOD mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用可部分受抑，且此抑制效應(yīng)呈劑量依賴性，與LPS組

11、相比有顯著性差異(P<0.01)；CCK-8單獨孵育也可抑制CuZn-SOD mRNA表達(dá)，與對照組相比有顯著性差異(P<0.01)。 3、CCK-8對LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)影響的受體機制預(yù)先用CR-1409、CR-2945處理TASMCs 10 min后，再分別加入LPS和CCK-8。CR-1409+CCK-8+LPS、CR-2945+CCK-8+LPS兩組CuZn-SOD mRNA表達(dá)均高于CCK

12、-8+LPS組(P<0.01)，但仍低于LPS組(P<0.05)，其中CR-2945的拮抗作用比CR-1409稍明顯。 結(jié)論： 在生理狀態(tài)下TASMCs CuZn-SOD基因有基礎(chǔ)表達(dá)；LPS可誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)增加；CCK-8可抑制TASMCs CuZn-SOD基因基礎(chǔ)表達(dá)，下調(diào)LPS對TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用，CCK-8通過其受體發(fā)揮上述調(diào)節(jié)作用，其中CCK-BR較C