心肌靶向納米粒的構(gòu)建及其功能效應(yīng)的初步評價(jià).pdf

1、研究背景:
　　膿毒癥(sepsis)是由細(xì)菌、真菌、病毒等感染因素導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)，起病急驟、病情危重、機(jī)制復(fù)雜、預(yù)后較差是其重要特征，通常會引起全身多臟器功能障礙、衰竭，已成為危重患者的常見死亡原因之一。研究表明，25％以上的膿毒癥患者合并心血管并發(fā)癥，心肌損傷是膿毒癥患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志。
　　目前臨床上并無針對性的措施來減輕心肌損傷，因此如何保護(hù)心功能，對改善危重患者身體狀況、提高膿毒癥的救治率具有重要意義。N

2、F-κB（nuclear factor-kappa B）是當(dāng)代研究的熱點(diǎn)，在過度炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中起關(guān)鍵性作用。研究證實(shí)，膿毒癥發(fā)生時(shí)，NF-κB的活性明顯升高，此時(shí)應(yīng)用siRNA(Small interfering Ribonucleic Acid)抑制NF-κB的P65亞基可有效抑制炎癥反應(yīng)。傳統(tǒng)的給藥方式中siRNA在體內(nèi)易被降解，納米技術(shù)不僅能有效保護(hù)siRNA，也能通過化學(xué)修飾后獲得主動靶向功能。
　　β1-腎上腺素受體

3、(β1-Adrenergic Receptors，β1-AR)在人體內(nèi)主要分布在心臟，心肌損傷時(shí)，膜表面受體的數(shù)量與敏感性均顯著上調(diào)，可作為納米粒的效應(yīng)靶點(diǎn)。親脂性化合物3-{4-[2-羥基-（1-甲基乙胺基）丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯(PAC)與β1-AR受體選擇性阻滯劑艾司洛爾(esmolol)具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以往的研究表明PAC修飾的脂質(zhì)體具有較強(qiáng)的心肌細(xì)胞特異靶向性。
　　故本課題設(shè)想，利用RNA干擾技術(shù)以及復(fù)合納米材

4、料的靶向性，體外構(gòu)建β1-AR介導(dǎo)的P65-NF-κB-siRNA心肌細(xì)胞靶向納米粒，并通過尾靜脈注射導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，觀察其在小鼠體內(nèi)的分布情況，建立急性內(nèi)毒素心肌損傷模型，研究其對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，從而實(shí)現(xiàn)減輕膿毒癥心肌損傷、保護(hù)心肌功能、提高膿毒癥救治率的目的。
　　研究方法:
　　1.艾司洛爾類似物PAC的合成
　　通過查閱文獻(xiàn)及總結(jié)交流，確定了以3-(4-羥基苯基)丙酸為起始原料，依次經(jīng)過羥基與十六烷醇成酯、環(huán)

5、氧丙基化、異丙胺化等步驟，最后得到終產(chǎn)物PAC的合成路線。
　　2.siRNA的設(shè)計(jì)合成與篩選
　　針對P65基因，設(shè)計(jì)合成3種不同的siRNA及陰性對照siRNA，利用lipo2000將siRNA分別轉(zhuǎn)染到小鼠心肌細(xì)胞系(HL-1)細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)24h后提取RNA行PCR擴(kuò)增，檢測各組基因表達(dá)情況，篩選出干擾效果最好的siRNA。
　　3.納米粒的合成
　　通過查閱文獻(xiàn)和借鑒經(jīng)驗(yàn)，確定了以siRNA+聚乙二醇(p

6、olyethylene glycol，PEG)為內(nèi)核、以聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]為納米材料、以維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(Vitamin E-Tocopheryl Polyethylene Glycol1000Succinate，TPGS)為乳化劑的制作方法，優(yōu)化試劑配比及操作步驟，制備心肌靶向納米粒，并利用激光粒徑儀、Zeta電位分析儀、掃描電子顯微鏡等進(jìn)行各表征分析

7、，通過紫外分光光度計(jì)檢測并計(jì)算納米粒的包封率、載藥量、釋放率等一系列指標(biāo)。通過單因素分析優(yōu)化制備工藝，以得到性質(zhì)最佳的納米粒。
　　4.納米粒的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞系(HL-1)，熒光顯微鏡檢測細(xì)胞表面β1-AR受體表達(dá)情況。將各組納米粒加入細(xì)胞培養(yǎng)混懸液中，通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞對納米粒的攝取及siRNA在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。將siNC納米粒和si435納米粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)24后提取RNA進(jìn)

8、行PCR擴(kuò)增，明確基因表達(dá)情況。
　　5.納米粒的動物實(shí)驗(yàn)
　　將不同納米粒通過尾靜脈注射到C57BL/6J小鼠體內(nèi)，24h后小鼠腹腔注射LPS(10mg/Kg)制作膿毒癥損傷模型，小動物成像儀檢測納米粒在體內(nèi)的分布情況;心尖穿刺取血檢測心肌酶譜、炎癥因子等的變化，取心臟組織行凋亡基因檢測和組織切片染色以明確心肌損傷情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.合成的艾司洛爾類似物PAC純度高，性質(zhì)穩(wěn)定，無生物學(xué)毒性，可用于進(jìn)

9、一步的合成研究。
　　2.轉(zhuǎn)染si435的細(xì)胞中mRNA水平表達(dá)最低，說明si435對NF-κB的P65亞基抑制作用最強(qiáng)，最終選擇si435作為心肌靶向納米粒的核心。
　　3.經(jīng)過不同配比的合成分析比對，875ul5％PEG+125ul siRNA作為內(nèi)水相，80mgPLGA+15mg TPGS+5mg PAC溶于8ml丙酮作為有機(jī)相，100ml0.03％TPGS作為外水相，按照此配比合成的納米粒粒徑均一，分散性好，電勢分布

10、集中，此時(shí)的包封率，載藥量，釋放曲線也比較穩(wěn)定。
　　4.小鼠心肌細(xì)胞系(HL-1)細(xì)胞膜表面有明顯β1-AR受體表達(dá);不同濃度的空白納米粒與細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞存活率未受影響，說明納米粒對細(xì)胞無毒性;熒光顯微鏡和流式細(xì)胞學(xué)檢測納米粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，發(fā)現(xiàn)納米粒分布均勻，細(xì)胞攝取率高，能穩(wěn)定進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并產(chǎn)生明顯的P65抑制效應(yīng)。
　　5.心肌靶向納米粒均有較強(qiáng)的心肌細(xì)胞靶向性，說明納米粒能靶向識別心肌細(xì)胞;小鼠腹腔注射LPS

11、(10mg/Kg)可導(dǎo)致明顯的心肌損傷，而注射si435納米粒組的心肌損傷程度明顯減輕;膿毒癥發(fā)生時(shí)，CK、LDH、HBDH均明顯升高，納米粒保護(hù)組的表達(dá)則顯著降低;炎癥因子、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況也有均有同樣的趨勢，說明si435納米粒能有效保護(hù)心肌細(xì)胞、降低膿毒癥心肌損傷。
　　研究結(jié)論:
　　1.成功合成艾司洛爾類似物PAC，純度高，性質(zhì)穩(wěn)定，無生物學(xué)毒性，可用于進(jìn)一步的合成研究。
　　2.篩選出干擾效果最好的s