攜帶自分泌運動因子基因的成肌細胞自體移植促進神經(jīng)肌肉功能恢復(fù).pdf

1、目的：
　　通過將攜帶自分泌運動因子(AMF)基因的成肌細胞自體移植到神經(jīng)植入術(shù)后的大鼠腓腸肌，觀察神經(jīng)肌肉功能的恢復(fù)情況，從而驗證作為腫瘤相關(guān)因子，AMF能否促進終板再生和神經(jīng)肌肉功能的修復(fù)；為AMF的應(yīng)用性研究和神經(jīng)植入術(shù)后神經(jīng)肌肉功能的改善提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、原代培養(yǎng)大鼠成肌細胞，鑒定后純化并擴增；
　　2、構(gòu)建攜帶AMF及eGFP基因的慢病毒載體，經(jīng)鑒定后，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的成肌細胞，并對后者

2、表達的AMF進行生物學(xué)活性鑒定；
　　3、建立大鼠腓腸肌失神經(jīng)支配及神經(jīng)植入術(shù)模型，并分為A組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的成肌細胞)、B組(攜帶AMF基因和eGFP基因的成肌細胞)、和C組(空白載體轉(zhuǎn)染的僅攜帶eGFP基因的成肌細胞)；于神經(jīng)植入術(shù)后第0天、第7天，將每只大鼠對應(yīng)的自體成肌細胞，注射移植于腓腸肌內(nèi)；
　　4、成肌細胞移植后第8、16、24周，腓腸肌冰凍切片觀察成肌細胞的存活情況；測定脛神經(jīng)功能指數(shù)(TFI)和神經(jīng)電生理指標，

3、后者包括復(fù)合肌肉動作電位(CMAP)的峰峰值(PPV)、曲線下面積(AUC)，并計算神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)；24周后通過AchE染色計數(shù)單位面積內(nèi)終板數(shù)量，并觀察腓腸肌組織形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)過21天的原代培養(yǎng)及純化，1cm3肌肉可獲得純度為98.0％的成肌細胞，平均5.6×106個；
　　2、構(gòu)建了攜帶AMF和eGFP基因的慢病毒載體并成功轉(zhuǎn)染成肌細胞，最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)為100。Transwel

4、l實驗證實：受AMF刺激后48小時內(nèi)穿過聚碳酸酯膜的NIH-3T3細胞為159±23.5個/視野，較對照組(94.6±36.1個/視野)明顯增多(P<0.05)，說明轉(zhuǎn)染后的成肌細胞能表達有活性的AMF；
　　3、成功建立大鼠腓腸肌失神經(jīng)支配及神經(jīng)植入術(shù)模型，成肌細胞移植后第8、16、24周均在腓腸肌中觀察到成肌細胞存活；
　　4、移植后8、16、24周，TFI(A組：-69.3±11.8，-46.5±8.0，-33.6±9

5、.1：B組：-57.5±9.1，-36.8±7.1，-25.2±6.4；C組：-67.7±8.2，-49.7±9.2，-34.2±8.7)、PPV(A組：8.5±2.3 mV、29.5±7.4％，12.4±2.4 mV、40.4±7.1％，18.6±2.9 mV、62.5±9.3％；B組：11.8±1.9 mV、39.0±5.2％，15.0±1.6 mV、39.0±5.2％，22.1±1.5 mV、39.0+±.2％；C組：8.7±1.

6、5 mV、30.0±5.4％，11.5±1.8 mV、39.2±6.2％，18.1±1.7 mV、60.9±5.4％)、AUC(A組：10.5±2.1 mV*ms、33.0±5.9％，13.7±2.5 mV*ms、41.2±6.8％，19.0±3.4 mV*ms、60.5±8.6％；B組：13.6±2.1 mV*ms、40.9±7.3％，16.8±3.1 mV*ms、50.7±9.3％，23.0±1.7 mV*ms、72.3±6.7％；

7、C組：9.6±2.6mV*ms、31.3±8.1％，13.7±2.9 mV*ms、42.4±9.9％，18.2±2.1 mV*ms、59.4±6.7％)測定和終板計數(shù)(A組：90.1±15.1/切片；B組：120.7±18.6/切片；C組：86±16.4/切片)顯示：B組明顯高于A、C組(P<0.01)，說明攜帶AMF基因的成肌細胞自體移植，能明顯促進神經(jīng)肌肉功能的恢復(fù)；而A、C組之間無顯著差異(P>0.05)，說明eGFP空白載體的轉(zhuǎn)