hBrd4 BD2和hMog1溶液結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、本論文工作的重點(diǎn)分為兩部分：第一部分是人類Brd4中兩個(gè)bromodomain的克隆、表達(dá)和純化，研究了它們在溶液中的存在狀態(tài)，并用核磁共振的方法解析了溶液中Brd4 BD2的結(jié)構(gòu)，研究了兩個(gè)bromodomain與乙?；慕M蛋白尾巴的相互作用，測定了它們的解離常數(shù)，分析了Brd4 BD2分別在游離狀態(tài)下和配基結(jié)合狀態(tài)下主鏈的動(dòng)力學(xué)特性，并用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法計(jì)算了由一個(gè)雙乙?；慕M蛋白小肽和兩個(gè)BD2組成的三元復(fù)合物模型；第二部分是

2、關(guān)于人類Mog1蛋白的表達(dá)純化以及溶液結(jié)構(gòu)的解析，并初步研究了它與Ran·GDP的相互作用。 論文的第一章闡述了第一部分的內(nèi)容。 第一章的第一部分詳細(xì)介紹了Brd4在生物體內(nèi)的重要作用。Brd4是一個(gè)多功能蛋白，它與不同的蛋白結(jié)合以發(fā)揮不同的功能。通過結(jié)合P-TEFb和mediator，調(diào)控轉(zhuǎn)錄的延長過程；通過結(jié)合RFC，調(diào)控DNA復(fù)制過程，并調(diào)節(jié)細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)變；通過與SPA-1結(jié)合，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并調(diào)控細(xì)

3、胞G2/M期的轉(zhuǎn)變；Brd4還參與到某些病毒的生命周期中去，或者調(diào)控病毒基因的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制，或者輔助病毒在細(xì)胞有絲分裂時(shí)均勻的分布到子代細(xì)胞中。所有的這些功能都是與它結(jié)合乙?；娜旧|(zhì)相聯(lián)系的。Brd4是BET家族的成員，解讀屬于它自己的組蛋白密碼，并將其翻譯成不同的細(xì)胞調(diào)控過程。 第一章的第二部分詳盡的描述了各種蛋白質(zhì)的克隆、表達(dá)、純化過程以及論文中所涉及到的其它實(shí)驗(yàn)過程。 第一章的第三部分是實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和討論。Brd4

4、BD2的溶液結(jié)構(gòu)表明，它是由保守的左手四螺旋束構(gòu)成，長的ZA loop上一些獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾使得BD2呈現(xiàn)出一個(gè)獨(dú)特的疏水口袋，以識(shí)別某些乙酰化的組蛋白尾巴。Brd4的BD1和BD2都能夠結(jié)合H4-AcK5和H4-AcK12，只是親和性有一些微小的差別，而且它們與單乙?；男‰慕Y(jié)合都很弱，解離常數(shù)都在毫摩爾數(shù)量級(jí)。我們鑒定了BD1和BD2在溶液中都主要以單體存在，而且當(dāng)它們以等摩爾比例混合時(shí)，也沒有異二聚體形成，這一結(jié)果與之前其它研

5、究小組的預(yù)測是完全不同的·Brd2BD1和TAFⅡ250通過形成同二聚體或者異二聚體而極大程度的增強(qiáng)了與乙酰化組蛋白尾巴的親和性。而Brd4不能以類似的方式增強(qiáng)與組蛋白尾巴的結(jié)合，因此，我們推測應(yīng)該有其它的機(jī)制來輔助這一過程。HPV E2蛋白建立了一個(gè)很好的模型，很可能在正常細(xì)胞中，一個(gè)尚未被發(fā)現(xiàn)的類似E2的蛋白輔助Brd4與染色質(zhì)的結(jié)合，當(dāng)然這個(gè)蛋白也可能就是mediator中的某一組分。主鏈動(dòng)力學(xué)分析表明，Brd4 BD2在結(jié)合了配

6、基之后，微秒．毫秒數(shù)量級(jí)的交換過程在一定程度上受到抑制，而皮秒-納秒數(shù)量級(jí)的快速運(yùn)動(dòng)則變化的不規(guī)律。論文的第二章闡述了第二部分的內(nèi)容。 到目前為止Mog1這個(gè)蛋白研究的并不多，而且主要都是來自于酵母的信息。論文中列舉了已有文獻(xiàn)報(bào)道的一些已知的功能，其中最主要的就是它能夠與Ran結(jié)合，參與調(diào)控生物分子的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。Ran在這一轉(zhuǎn)運(yùn)體系中扮演著重要的角色，Mog1與Ran·GTP和Ran-GDP都能夠緊密結(jié)合，并促使Ran將核苷酸

7、釋放出去，空載狀態(tài)下的Ran仍然能夠與Mog1緊密結(jié)合。但這種結(jié)合在核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中確切的分子機(jī)制還不清楚。Mog1參與SLN1-SKN7信號(hào)傳導(dǎo)途徑，能夠直接與途徑中的某些蛋白相互作用，而且從某種意義上說，這一功能應(yīng)該還是與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相聯(lián)系的。此外，Mog1可能還參與RNA代謝和脂類代謝過程。 我們表達(dá)純化了人類Mog1和Ran蛋白，并用核磁共振方法解析了hMog1的溶液結(jié)構(gòu)，研究了它們相互作用的特性，希望能夠找到它們的結(jié)合界面，