FAT10在肝癌和結(jié)腸癌患者血漿中的表達及診斷價值分析.pdf

1、背景和目的：肝癌和結(jié)腸癌均是世界范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在亞太地區(qū)惡性腫瘤死亡率中分別位列第3和第5位。且近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率明顯上升。早期肝癌缺乏典型臨床癥狀,癥狀顯著者大多已進入中晚期。當前，手術(shù)切除是治療肝癌最好的方法。中晚期肝癌的治療方案還包括肝動脈栓塞術(shù)（TACE），無水酒精注射（PEI）和射頻消融術(shù)。盡管存在這些治療方法，但是肝癌的早期診斷仍然是改善患者預后的重要途徑。甲胎蛋白(α-fetoprotein，A

2、FP)作為肝癌早期診斷的主要血清學診斷指標，因其具有非侵入性的優(yōu)勢被廣泛應用。臨床應用中發(fā)現(xiàn)，AFP在早期肝癌和小肝癌診斷中的敏感性和特異性不夠令人滿意。早期肝癌中40％的AFP是陰性的。2010年，美國肝病研究協(xié)會（AASLD）在其公布的肝癌診斷指南中，不再使用AFP作為肝癌的篩查指標。另外，多數(shù)肝癌疑似患者并不容易接受肝臟穿刺活檢，因為它屬于有創(chuàng)性檢查，組織學診斷這一金標準在臨床應用中受到限制。因此，探索新的血清學標記物應用于肝癌和

3、結(jié)腸癌的早期診斷有一定的必要性。
　　FAT10 mRNA（人類白白細胞抗原信使RNA，human leukocyte antigen-F adjacent transcript10 mRNA）位于人類6號染色體上，I型主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)編碼區(qū)域的末端,緊挨人類白細胞抗原的F區(qū),由此而得名。FAT10蛋白包含165個氨基酸殘基，最初因為其C端和N端與泛素

4、蛋白高度相似而被命名為雙泛素蛋白。FAT10蛋白隸屬于類泛素蛋白家族，并且可以通過蛋白酶體系統(tǒng)參與蛋白質(zhì)的降解過程。FAT10 mRNA定位于真核生物細胞核,通過結(jié)合人類紡錘體檢查位點 MAD2參與細胞周期循環(huán)管理,MAD2的異常調(diào)節(jié)和染色體不穩(wěn)定性有關(guān)。最近發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10 mRNA可參與管理細胞周期循環(huán)、誘導染色體不穩(wěn)定性，參與修飾腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，而染色體不穩(wěn)定性可以

5、導致腫瘤發(fā)生。我們在前期實驗中,應用含有19378個已知基因的核苷酸芯片篩選出肝癌、肝硬化和病毒性肝炎差異基因表達圖譜,結(jié)果表明FAT10基因在肝癌中顯著高表達。有研究證明，炎性環(huán)境下FAT10基因在肝癌和結(jié)直腸癌組織中高表達。但是，血漿中FAT10 mRNA及蛋白表達水平，可否作為肝癌和結(jié)腸癌的一種血清學診斷標志目前還未有研究。
　　在本實驗中，應用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實驗方法（EL

6、ISA）測定FAT10 mRNA和蛋白在肝癌、結(jié)腸癌、肝硬化及健康志愿者血漿中的表達水平，通過分析FAT10蛋白在肝癌和結(jié)腸癌診斷中的靈敏度和特異度，評估其臨床診斷價值。
　　材料和方法：
　　1.材料：
　　臨床研究資料：70例肝癌血漿樣本取自2014年6月-2015年4月河南省人民醫(yī)院肝膽外科和消化內(nèi)科住院患者,另選同期住院60例肝硬化、64例結(jié)腸癌患者，64例健康志愿者選自體檢中心。70例肝癌中男51例、女19例

7、,年齡54.03歲±8.93歲。所有肝癌患者均進行TNM分期,并使用Child-Pugh方法評估肝臟功能分級。結(jié)腸癌患者中男38例,女26例,年齡53.55歲±6.56歲,使用Duke's方法進行分期。肝癌和結(jié)腸癌患者血樣本收集前均未行放療或化療,依靠超聲、CT，MRI等方法診斷，且經(jīng)術(shù)后病理證實。正常對照組選取同時期體檢健康志愿者，所有參加研究患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。
　　2.方法：
　　2.1

8、PCR：分別提取肝癌、結(jié)腸癌、肝硬化和健康對照組血漿中總RNA，應用紫外分光光度計檢測A260/A280吸光度比值，若A260/A280在1.8-2.0之間說明所提取的RNA純度良好，可進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后嚴格按照購自日本TAKARA公司的RT-PCR試劑盒檢測不同組別中血漿FAT10 mRNA陽性表達率，PCR反應結(jié)束后出現(xiàn)熔解曲線和擴增曲線，將CT值在18-35之間定義為表達陽性，利用所得CT值計算產(chǎn)物相對表達量。
　

9、　2.2. ELISA檢測隨機選取部分血漿進一步進行ELISA實驗，本實驗選取肝癌血漿70例，肝硬化血漿40例，結(jié)腸癌患者、正常人血漿各32例，實驗前規(guī)劃空白孔、標準品孔、樣本孔，嚴格按照FAT10-ELISA試劑盒說明書進行操作。實驗結(jié)束后，利用96孔酶標儀測出每孔相應的OD值。根據(jù)標準品繪制標準曲線,或者得出四參數(shù)分析公式，通過已知標準品濃度值計算樣品濃度值。
　　3.統(tǒng)計分析
　　FAT10 mRNA相對表達量和蛋白計

10、量資料以均數(shù)士標準差(mean士SD)表示。多組之間比較采用方差分析、Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗。FAT10和AFP與臨床特征之間相關(guān)檢驗運用Mann-Whitney U檢驗或者Kruskal-Wallis檢驗。受試者工作特征曲線（ROC curve）被用于分析FAT10蛋白和AFP蛋白的診斷價值。應用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件分析肝癌、肝硬化及健康組之間FAT10

11、mRNA和蛋白表達頻率差異。制圖工具選用GraphPad6.0版（(Graph Pad Software,La Jolla，CA，USA）。雙側(cè)檢驗P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.FAT10 mRNA在各組中的表達水平
　　肝癌、肝硬化、健康組血漿FAT10 mRNA的陽性表達率分別為72.85%（51/70），28.3%(17/60)和12.5%(8/64)，三者之間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<

12、0.01)；肝癌組FAT10陽性表達率明顯高與肝硬化組(P<0.01)和正常志愿者(P<0.01)。肝硬化組與健康志愿者比較無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。三組中FAT10 mRNA的相對表達量分別為6.83士3.37,2.14士0.70,1.08士0.46,三組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。肝硬化和健康志愿者之間差異無明顯統(tǒng)計學差異。肝癌患者血漿FAT10 mRNA表達水平與肝癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)，

13、結(jié)腸癌組中FAT10 mRNA相對表達量為4.04士3.33,陽性表達率為59.4%(38/64),與健康組比較差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且FAT10 mRNA上調(diào)表達與結(jié)腸癌Duke’s分期（P<0.05)及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。FAT10 mRNA在AFP陰性肝癌中的敏感度為68.8%，當比較小肝癌和非肝癌組（肝硬化和健康志愿者）時，發(fā)現(xiàn)其敏感度為68.8%，特異度為79.8%。
　　2.FAT10蛋白

14、表達水平
　　血漿FAT10蛋白在肝癌、肝硬化、健康志愿者中平均表達濃度依次是293.855±127.61pg/ml、169.30±58.659pg/ml、142.87±70.08pg/ml。三組差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=53.34，P<0.01）。肝癌組分別與肝硬化、健康組比較均具有明顯統(tǒng)計學差異（P<0.05）。肝硬化和健康組比較無明顯統(tǒng)計學差異（P=0.086），盡管FAT10蛋白在肝硬化中也有輕度上調(diào)表達。肝癌血漿中FAT

15、10蛋白濃度高表達與TNM分期(P=0.034，<0.05)和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P=0.032，<0.05）。
　　FAT10蛋白在AFP陰性肝癌，小肝癌的平均表達濃度依次是271.57±128.68pg/ml、299.71±110.02pg/ml。分別與健康志愿者比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。血漿FAT10蛋白在結(jié)腸癌的平均表達濃度是192.806±61.69pg/ml。結(jié)腸癌組和健康組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P

16、<0.05），并且FAT10蛋白在結(jié)腸癌中的濃度與結(jié)腸癌患者Duck’s分期和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　3.ROC曲線分析結(jié)果
　　利用ROC分析血漿FAT10蛋白濃度結(jié)果，綜合靈敏度和特異度分析診斷方法的準確度。當肝癌與非肝癌組相比較時，根據(jù)國際推薦標準，以20ng/ml為AFP臨界值，得出AFP蛋白敏感度和特異度分別為78.6%和81.9%。運用ROC曲線，得出FAT10蛋白質(zhì)最佳臨界值為194.14pg/ml,肝癌與健康組相

17、鑒別AUC值為0.874（95%置信區(qū)間：0.800-0.949），敏感度78.6%，特異度87.5%。肝癌與肝硬化相鑒別AUC值為0.826（95%置信區(qū)間：0.749-0.903），敏感度為78.6%，特異度77.5%。小肝癌與非肝癌相鑒別AUC值為0.865（95%置信區(qū)間：0.717-0.955)。當小肝癌組與肝硬化相鑒別時敏感度和特異度分別為75.0%和77.5%、與健康志愿者組相鑒別時FAT10的敏感度和特異度分別為75.0

18、%和84.4%。聯(lián)合FAT10蛋白和AFP蛋白，診斷敏感度可以上升到81.3%。
　　ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)當AFP陰性肝癌與非肝癌組比較時，AUC值是0.836(95%置信區(qū)間:0.724-0.947)，進一步分析當AFP陰性肝癌分別與肝硬化、健康組相鑒別均具有較好的診斷意義，AUC值分別為0.797(95%置信區(qū)間：0.660-0.934)、0.884(95%置信區(qū)間：0.785-0.982)；特異度分別為77.5%、87.5%。

19、
　　結(jié)論：
　　1.肝癌組血漿中FAT10 mRNA和蛋白水平較對照組均明顯增高。FAT10 mRNA與肝癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。FAT10蛋白與肝癌的TNM分期及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。血漿FAT10 mRNA和蛋白在結(jié)腸癌患者中的表達水平較健康志愿者明顯升高，并且與腫瘤Duke’s分期及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。這些提示FAT10可能參與肝癌和結(jié)腸癌的發(fā)生和進展。
　　2.ROC曲線表明FAT10蛋白作為肝癌無創(chuàng)性診斷標志物