茶樹倍半萜類物質(zhì)代謝及其對(duì)蟲害脅迫響應(yīng).pdf

1、萜類化合物，又稱類異戊二烯，是已知最大的一類次生代謝產(chǎn)物，從各類生物中發(fā)現(xiàn)的萜類物質(zhì)有超過(guò)55000種。許多植物源的萜類化合物在植物與環(huán)境的相互作用中發(fā)揮重要功能。單萜、倍半萜和少數(shù)二萜、三萜分子量較小，具有較低的蒸氣壓，從而能夠以氣態(tài)形式被植物釋放，是植物種群間、植物-昆蟲間的重要化學(xué)信號(hào)媒介。本論文旨在系統(tǒng)地分析鑒定茶樹倍半萜類揮發(fā)物種類、發(fā)掘茶樹倍半萜類合成相關(guān)基因、明確倍半萜類合成酶功能，進(jìn)而揭示倍半萜類物質(zhì)代謝對(duì)各種脅迫的響應(yīng)

2、機(jī)制。本文以茶種Camellia sinensis(L.) O.Kuntze的普洱茶變種C.sinensis var.assamica和茶變種C.sinensis var.sinensis茶樹花為材料，全面解析了茶樹組成性萜類揮發(fā)物;通過(guò)非生物和生物脅迫處理，分析了茶樹誘導(dǎo)性萜類揮發(fā)物。建立了2個(gè)茶樹變種的花轉(zhuǎn)錄組和蟲害誘導(dǎo)茶變種的葉片組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)掘了茶樹萜類MVA和MEP代謝途徑的關(guān)鍵基因，驗(yàn)證了其功能。分離了10個(gè)茶樹萜類合

3、成酶，通過(guò)體外表達(dá)檢測(cè)了其酶活性;以擬南芥為模式植物，轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證了茶樹萜類合成酶基因1(CsTPS1功能。比較了茶樹對(duì)咀嚼式和刺吸式害蟲為害的差異響應(yīng)，初步證明了茉莉素(Jasmonates，JAs)是蟲害誘導(dǎo)茶樹萜類代謝的主導(dǎo)信號(hào)。
　　具體研究結(jié)果如下:
　　1、茶花是茶樹組成性萜類物質(zhì)生成的主要器官，普洱茶變種茶樹花萜烯揮發(fā)物總量很大，包括約10種左右的單萜和27種倍半萜揮發(fā)物，其中倍半萜是主要萜烯產(chǎn)物，但茶變種茶樹花

4、萜類物質(zhì)總量非常少，僅釋放少量單萜，且主要是芳樟醇氧化物，基本無(wú)倍半萜產(chǎn)生。無(wú)論是種植在杭州的普洱茶變種茶樹資源，還是分布在云南各地的同類種質(zhì)資源，它們花中含有的萜類成分基本一致，不受環(huán)境等因素影響，這說(shuō)明普洱茶變種和茶變種茶樹花從表型和遺傳上都顯示了進(jìn)化上的顯著差異。生物和非生物脅迫能夠誘導(dǎo)茶樹釋放萜烯揮發(fā)物，兩者的誘導(dǎo)效應(yīng)明顯不同。蟲害十分顯著的誘導(dǎo)α-法尼烯α-farnesene和反式橙花叔醇trans-nerolidol，其中t

5、rans-nerolidol是其特異誘導(dǎo)萜烯揮發(fā)物。
　　2、建立了蟲害葉片轉(zhuǎn)錄組和茶花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)從頭測(cè)序(de novo)拼接發(fā)掘茶樹萜類合成相關(guān)功能基因。獲得10個(gè)全長(zhǎng)茶樹萜類合成酶基因，其蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)顯示8個(gè)成員是倍半萜合成酶基因，1個(gè)具有單萜合成酶特征，1個(gè)為雙萜合成酶基因。分離了茶樹萜烯MVA途徑第一步限速酶HMGS的2個(gè)基因成員CsHMGR1-2， MEP途徑第一步限速酶DXR的1個(gè)基因CsDXR。還注釋了ME

6、P途徑的2個(gè)DXS基因，JAs信號(hào)途徑作用元件相關(guān)基因COI1a-b、JAZ1-2、CsMYC2a-b等，以進(jìn)一步研究茶樹萜類代謝的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。CsHMGR1能夠被茶尺蠖和小綠葉蟬顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明蟲害能夠誘導(dǎo)該基因表達(dá)，促進(jìn)萜類物質(zhì)生成。CsDXR在細(xì)菌中可以顯著促進(jìn)pAC-BETA質(zhì)粒合成胡蘿卜素，說(shuō)明它具備合成萜烯前體物的功能。從蟲害葉片轉(zhuǎn)錄組和茶花轉(zhuǎn)錄組中分離的萜類合成酶基因有序列上的同源性，有的同時(shí)存在于兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組中，有的則只在

7、蟲害誘導(dǎo)條件下表達(dá)，有的則僅在花中表達(dá)，負(fù)責(zé)花香中單萜和倍半萜揮發(fā)物的合成釋放。
　　3、本研究分離的這些茶樹萜類合成酶基因，盡管它們都具有典型的植物萜類合成酶特征，但通過(guò)原核表達(dá)，酶活分析發(fā)現(xiàn)這些茶樹TPS活性普遍很弱，僅能合成微量倍半萜。根據(jù)對(duì)普洱茶變種茶樹花萜類揮發(fā)物的分析和其它植物TPS的研究經(jīng)驗(yàn)判斷，茶樹的TPS可能在不同茶樹變種之間產(chǎn)生功能分歧，這種進(jìn)化導(dǎo)致來(lái)源于茶變種即小葉種茶樹的TPS倍半萜合成能力退化或丟失。在小

8、菜蛾為害處理下，茶樹CsTPS1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的長(zhǎng)葉烯longifolene釋放比野生型植株增加6-26倍，且抗蟲性顯著強(qiáng)于野生型擬南芥。分離了茶樹三萜角鯊烯合成酶基因CsSQS，原核表達(dá)和酶活性分析顯示，去除跨膜蛋白的突變CsSQS-mutant1可以縮合2分子FPP，生成角鯊烯squalene，并發(fā)現(xiàn)了1個(gè)茶花中含有大量角鯊烯的特異茶樹資源。
　　4、咀嚼式害蟲茶尺蠖和刺吸式害蟲小綠葉蟬對(duì)茶樹萜烯揮發(fā)物的誘導(dǎo)效應(yīng)不同，茶尺蠖

9、能夠誘導(dǎo)茶樹釋放出單萜3-蒈烯和倍半萜橙花叔醇，而葉蟬為害則不能誘導(dǎo)這2種萜類揮發(fā)物，說(shuō)明咀嚼式害蟲茶尺蠖對(duì)茶樹萜烯的誘導(dǎo)作用更明顯。當(dāng)然蟲害的誘導(dǎo)效應(yīng)受茶樹的樹齡和生長(zhǎng)狀態(tài)、昆蟲取食能力、環(huán)境因子等因素影響。HMGR的抑制劑洛伐他汀lovastatin處理茶苗，能夠抑制蟲害后茶樹環(huán)長(zhǎng)葉烯longicyclene和長(zhǎng)葉烯longifolene這兩種倍半萜的釋放，證明體外信號(hào)的處理可以調(diào)控茶樹萜烯代謝。用JAs信號(hào)抑制劑布洛芬Ibupro