擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架參與細(xì)胞外鈣調(diào)素調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)的研究.pdf

1、已有的研究表明細(xì)胞外鈣調(diào)素(CaM)存在于蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)并能促進(jìn)氣孔關(guān)閉,抑制氣孔開放.而微絲骨架參與了多種細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的氣孔運(yùn)動(dòng),但還不清楚是否參與以及如何參與細(xì)胞外CaM在保衛(wèi)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).該研究在表皮條生物學(xué)分析的基礎(chǔ)上,主要利用激光共聚焦顯微技術(shù),轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究了微絲骨架在細(xì)胞外CaM調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)中的作用.免疫印跡和免疫熒光定位結(jié)果表明擬南芥的保衛(wèi)細(xì)胞壁存在CaM;外源CaM能夠促進(jìn)擬南芥氣孔關(guān)閉并抑制光照誘導(dǎo)的氣孔開

2、放;不過膜的大分子CaM的拮抗劑W7-agarose和CaM抗血清在無外源CaM的情況下,均能抑制氣孔的正常關(guān)閉,促進(jìn)氣孔的正常開放,說明內(nèi)源細(xì)胞外CaM和外源CaM一樣,也是氣孔運(yùn)動(dòng)的一個(gè)調(diào)節(jié)因子.以表達(dá)GFP-mTn融合蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料,利用激光共聚焦掃描技術(shù)研究了細(xì)胞外CaM對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架動(dòng)態(tài)變化的調(diào)控作用.結(jié)果表明細(xì)胞外CaM能誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架的解聚,這種解聚作用是時(shí)間依賴的;而微絲骨架的拮抗劑細(xì)胞松馳素.D(C

3、D)和穩(wěn)定劑鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)分別能促進(jìn)和抑制細(xì)胞外CaM誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉.因此推測(cè)微絲骨架的解聚參與了細(xì)胞外CaM誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,并是細(xì)胞外CaM誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉所必需的.細(xì)胞外CaM能誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞[Ca<'2+>]<,cyt>升高.當(dāng)[Ca<'2+>]<,cyt>升高被抑制后,細(xì)胞外CaM不能誘導(dǎo)微絲骨架解聚和氣孔關(guān)閉.這個(gè)結(jié)果表明細(xì)胞外CaM可能通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞[Ca<'2+>]<,cyt>升高,來促進(jìn)微絲骨架的解聚,進(jìn)而

4、導(dǎo)致氣孔關(guān)閉.利用RT-PCR的方法克隆了擬南芥微絲解聚因子AtADF2 cDNA的全長(zhǎng),經(jīng)過原核表達(dá)得到了AtADF2的融合蛋白并制備了其抗體.Western實(shí)驗(yàn)證實(shí)AtADF2在各個(gè)營養(yǎng)組織中都有表達(dá),其中葉片中含量最高.免疫熒光定位結(jié)果表明ADF2存在于保衛(wèi)細(xì)胞中.利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了ADF2的正義和反義表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株.ADF2的過量表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞外CaM誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,而抑制ADF2的表達(dá)則有相反的結(jié)果,但CD的處理能消除這種

5、抑制作用.這些結(jié)果暗示植物體內(nèi)ADF2的過量表達(dá)能夠促進(jìn)保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架的解聚,從而促進(jìn)了氣孔對(duì)細(xì)胞外CaM的反應(yīng).利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了保衛(wèi)細(xì)胞中AtPROFILIN1大量表達(dá)的陽性植株,生物學(xué)分析表明AtPROFILIN1的過量表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞外CaM誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,CD不能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株氣孔對(duì)細(xì)胞外CaM的反應(yīng),而Phalloidin卻能抑制這一過程.熒光標(biāo)記保衛(wèi)細(xì)胞中的微絲骨架,結(jié)果表明AtPROFILIN1的過量表達(dá)使得保衛(wèi)細(xì)胞中

6、的微絲骨架解聚.這些結(jié)果表明PROFILIN1的過量表達(dá)促進(jìn)了保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架,從而促進(jìn)了氣孔對(duì)細(xì)胞外CaM的反應(yīng).AtPROFILIN1和AtADF2的過量表達(dá)也促進(jìn)氣孔對(duì)光照,黑暗和ABA的反應(yīng),說明在復(fù)雜的保衛(wèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中,多種細(xì)胞外信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)是相互交錯(cuò)的.在該文研究中,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外CaM是通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架的解聚來促進(jìn)氣孔關(guān)閉的,轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn).CaM可能是通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞[Ca<'2+>]<