糖濃度增加致海馬神經(jīng)元MLCK升高對細(xì)胞微絲骨架的影響.pdf

1、目的：原代培養(yǎng) SD新生鼠海馬神經(jīng)元，倒臵顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)，透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)；Western blotting檢測MLCK、p-MLC表達(dá)水平；免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察 F-actin的變化；探討糖濃度增加海馬神經(jīng)元中 MLCK升高對神經(jīng)元微絲骨架的影響，推測其改變在糖尿病認(rèn)知功能障礙中的機制。
　　方法:1.原代培養(yǎng)SD新生鼠海馬神經(jīng)元及其純度鑒定：無菌條件下分離SD新生鼠海馬并進(jìn)行原代培養(yǎng)，倒臵相差

2、顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；每2天采用CCK-8檢測海馬神經(jīng)元活性，細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，NSE免疫組化染色鑒定其純度；2.實驗分組：對照組、高糖組、ML-7組。其中，對照組用葡萄糖濃度為25mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖組細(xì)胞培養(yǎng)至第5天換用糖濃度為45mmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時；ML-7組在高糖作用的同時加入 MLCK抑制劑ML-7（20μmol/L）作用8小時。3. Western blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)MLCK、p-MLC表達(dá)水平。4.

3、透射電鏡觀察各組海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變。5.進(jìn)行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察各組微絲成分F-actin的變化。
　　結(jié)果：1.成功培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，倒臵相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)7d的神經(jīng)元形態(tài)成熟，體積較大，聚集存活，光暈明顯；突起發(fā)達(dá)并向外延伸，互相連接形成密集交錯的網(wǎng)絡(luò)。且培養(yǎng)7天的海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性達(dá)到最高，之后產(chǎn)生短暫的平臺期，11d后活性逐漸下降，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度達(dá)90％以上；2.與對照組相比，高糖組細(xì)胞內(nèi)p-MLC、M

4、LCK均上調(diào)（P＜0.05），ML-7組 p-MLC、MLCK均較高糖組表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；3.與對照組相比，高糖組海馬神經(jīng)元突觸縮短，超微結(jié)構(gòu)顯示海馬神經(jīng)元細(xì)胞核膜皺縮，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)分布不均、顆?；?、凝集成塊并邊集，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體有囊泡化擴張，伴隨有自噬現(xiàn)象的產(chǎn)生，且微絲成分減少；與高糖組相比，ML-7組在細(xì)胞及線粒體方面無明顯變化，細(xì)胞中出現(xiàn)極少自噬現(xiàn)象，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器改變不大，微絲更豐富。4.免疫熒光顯示