高產(chǎn)桿菌肽地衣芽胞桿菌的鑒定與選育.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptide)是一類(lèi)廣泛存在于自然界生物體中的小肽類(lèi)物質(zhì)，它是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分?？咕木哂歇?dú)特殺菌機(jī)制和廣譜抗菌性，不易造成病原菌的耐藥性。一些抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞有廣譜殺滅活性，為癌癥患者提供了一類(lèi)新型的抗癌藥物，其在醫(yī)藥、養(yǎng)殖、食品、生物防治等方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。
　　本實(shí)驗(yàn)擬從天然界篩選得到1株抑菌活性較強(qiáng)、抑菌譜較廣的芽胞桿菌，并通過(guò)分離純化得到其主要抑菌活性物質(zhì)，再通過(guò)

2、全基因組改組方式提高其主要活性物質(zhì)產(chǎn)量。主要研究結(jié)果如下:
　　1.抗菌活性芽胞桿菌的篩選與鑒定:從天然原桃膠中分離到一株有抑菌活性物質(zhì)的芽胞桿菌TJ12。其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌(StapHylococcusaureus)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)和串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)有抑菌活性。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)、16S rR

3、NA序列和gyrB序列將TJ12菌株鑒定為地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)。
　　2.抑菌活性物質(zhì)的分離純化與鑒定:通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑萃取、羥丙基葡聚糖凝膠層析、高效液相色譜分離純化，得到其主要活性物質(zhì)。該物質(zhì)對(duì)pH、溫度和三種蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶）有較好的穩(wěn)定性。經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜分析，初步鑒定該株地衣芽胞桿菌TJ12的主要抑菌物質(zhì)為桿菌肽A。
　　3.基因改組選育高產(chǎn)桿

4、菌肽地衣芽胞桿菌及改組菌株差異分析:為了提高地衣芽胞桿菌桿菌肽產(chǎn)量，采用全基因組改組技術(shù)進(jìn)行菌株選育。以地衣芽胞桿菌TJ12為原始菌株，通過(guò)紫外(UV)誘變、亞硝基胍(NTG)誘變、常壓室溫等離子體(ARTP)誘變構(gòu)建了TJ12菌的突變體庫(kù)。在優(yōu)化其原生質(zhì)體制備和再生條件的基礎(chǔ)上，以其中4株誘變菌株(U11、U23、H1、L71)作為親本，采用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的方法進(jìn)行三輪多親本的全基因組改組，同時(shí)，結(jié)合雙親滅活的篩選方法，最終選