“地五養(yǎng)肝膠囊”抗大鼠肝纖維化及調(diào)節(jié)EMT-MET失衡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過觀察體現(xiàn)“補(bǔ)腎生髓成肝”治療法則的湖北省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑“地五養(yǎng)肝膠囊”（鄂藥制字Z20113160）對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的干預(yù)作用，探討“地五養(yǎng)肝膠囊”調(diào)控EMT/MET的失衡的作用機(jī)制，為肝纖維化的臨床治療提供新的治療思路和方向，揭示EMT/MET失衡所致的“髓失生肝”病因病機(jī)和“補(bǔ)腎生髓成肝”調(diào)控EMT/MET失衡的科學(xué)內(nèi)涵。
　　 方法:用50％ CCL4/大豆油溶液皮下多點(diǎn)注射法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。

2、將SPF級Wistar雄性大鼠20只隨機(jī)分為三組:空白對照組，肝纖維化模型組（以下簡稱“模型組”），“地五養(yǎng)肝膠囊”治療用藥組（以下簡稱“治療組”）。模型組和治療組大鼠給予50％ CCL4/大豆油溶液皮下注射6周，2次/周，劑量為1 ml/kg。同時空白對照組給予等劑量的大豆油皮下注射6周。在造模的同時，治療組大鼠給予“地五養(yǎng)肝膠囊”溶液灌胃，1次/日，劑量為360 mg/kg，共6周。而模型組和空白對照組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃作為

3、對照。造模6周后處死大鼠，分別取空白對照組、模型組和治療組的肝組織測定肝指數(shù)和羥脯氨酸含量，并進(jìn)行肝組織蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色，以觀察肝臟損傷程度和膠原纖維增生程度。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western-blotting)觀察肝組織E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的mRNA和蛋白表達(dá)。RT-PCR法和Western-blotting法所拍的圖像用Gel

4、-pro analyzer軟件進(jìn)行處理，選定分析區(qū)域，獲取平均積分光密度值(Integrated option density，IOD)。所有數(shù)據(jù)均利用統(tǒng)計軟件SPSS17.0處理，結(jié)果以(x)±s表示。多個樣本均數(shù)的組間兩兩比較采用方差分析聯(lián)合SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果繪制圖表。
　　 結(jié)果:羥脯氨酸含量結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織的羥脯氨酸含量(207.39±31.66)較空白對照組大鼠的（13

5、5.12±17.74）明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，兩者差異顯著，p＜0.05。經(jīng)“地五養(yǎng)肝膠囊”治療后，治療組大鼠肝組織的羥脯氨酸含量(155.16±25.22)較模型組明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，兩者差異顯著，p＜0.05。HE染色和Masson染色顯示給予“地五養(yǎng)肝膠囊”治療后能減輕肝細(xì)胞損傷，并降低肝纖維化的程度。PCR結(jié)果顯示:模型組的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的mRNA含量（0.364±0.12）明顯低于空白對照組（0.593

6、±0.12），而間皮細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的mRNA含量（0.456±0.08）明顯高于空白對照組（0.310±0.06），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異顯著，p＜0.05。模型組中上皮細(xì)胞標(biāo)志物減少、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物增高表明CCL4誘導(dǎo)的大鼠在肝纖維化過程中發(fā)生了EMT。經(jīng)“地五養(yǎng)肝膠囊”治療后，治療組與模型組和空白對照組相比，治療組大鼠肝組織的E-cadherin的mRNA含量（0.476±0.17）的表達(dá)明顯高于模型組（0.364±0.12

7、）而低于空白對照組（0.593±0.12），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異顯著，p＜0.05。治療組大鼠肝組織Vimentin的mRNA含量（0.348±0.12）的表達(dá)明顯低于模型組（0.456±0.08），兩者經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異顯著，p＜0.05。Western blotting結(jié)果顯示:模型組大鼠與空白對照組大鼠相比較，模型組的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)（0.631±0.57）明顯低于空白對照組（3.666±2.38），間皮細(xì)

8、胞標(biāo)志物Vimentin蛋白的表達(dá)（2.745±1.85）高于空白對照組（1.441±1.37），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異顯著，p＜0.05。經(jīng)“地五養(yǎng)肝膠囊”治療后，治療組與模型組相比，治療組的E-cadherin蛋白的表達(dá)（1.723±1.47）高于模型組（0.631±0.57），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異顯著，p＜0.05。而Vimentin蛋白的表達(dá)（2.274±0.93）弱于模型組(2.745±1.85)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異不顯著，p＞0.