地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化薯渣與汁水效能及其代謝機(jī)理研究.pdf

1、馬鈴薯淀粉工業(yè)廢棄物的處理一直是困擾馬鈴薯淀粉企業(yè)的重大難題。大量的馬鈴薯廢渣（薯渣）和廢水（汁水）造成的污染正嚴(yán)重危害著環(huán)境。液態(tài)發(fā)酵薯渣與汁水生產(chǎn)細(xì)胞蛋白的生物技術(shù)，既能解決環(huán)境污染的問題，又能通過資源化給企業(yè)帶來額外效益，是一種可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的高新技術(shù)。目前，進(jìn)一步降解薯渣與汁水中的纖維素，提高細(xì)胞蛋白產(chǎn)量的研究備受關(guān)注。
　　本文通過改進(jìn)并優(yōu)化原有的發(fā)酵工藝和微生物群體動(dòng)態(tài)的分析，對該技術(shù)中的重要菌種地衣芽孢桿菌（Bacil

2、lus licheniformis）轉(zhuǎn)化薯渣與汁水效能進(jìn)行了研究；構(gòu)建了地衣芽孢桿菌基于代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)模型，對生物轉(zhuǎn)化過程的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行了模擬；通過地衣芽孢桿菌bglC和bglH基因敲除菌株與野生型之間的代謝通量的差異分析，研究了地衣芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的代謝機(jī)理，為進(jìn)一步提高薯渣與汁水的轉(zhuǎn)化效率提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。
　　地衣芽孢桿菌發(fā)酵薯渣與汁水工藝的改進(jìn)。單獨(dú)使用地衣芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)，纖維素降解率僅有46.1％。因此建立了先

3、用黑曲霉（Aspergillus niger）H3菌株發(fā)酵降解纖維素，再用地衣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)胞蛋白的兩步法發(fā)酵工藝。為了進(jìn)一步提高薯渣與汁水的轉(zhuǎn)化效率，利用響應(yīng)面分析法，對地衣芽孢桿菌發(fā)酵過程中的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。在發(fā)酵溫度為32.8℃，pH為6.7，接種量為1.8%的條件下，發(fā)酵液上清蛋白減少量最多，達(dá)到0.93g/L，產(chǎn)物中粗蛋白含量達(dá)到38%以上，純蛋白含量達(dá)到24%以上，說明發(fā)酵產(chǎn)品具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。利用末端限制性片段長

4、度多態(tài)性的分析方法，對發(fā)酵過程中微生物群體動(dòng)態(tài)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明芽孢桿菌在發(fā)酵過程中占優(yōu)勢地位并發(fā)揮主導(dǎo)作用。發(fā)酵8h后，芽孢桿菌大量生長，并抑制了薯渣與汁水中土著菌的生長，而在發(fā)酵32h后，芽孢桿菌數(shù)量開始減少，土著菌有所生長。
　　地衣芽孢桿菌的中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝通量分析。通過改進(jìn)13C代謝通量分析方法、去除質(zhì)譜誤差、檢測胞外代謝物濃度及建立地衣芽孢桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)，利用13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了地衣芽孢桿菌的代謝通量分析。結(jié)果顯示

5、64.7%的葡萄糖生成了6磷酸果糖，26.7%的葡萄糖流向磷酸戊糖途徑?；匮a(bǔ)途徑的通量達(dá)到葡萄糖攝入通量的4倍以上，說明回補(bǔ)途徑反應(yīng)迅速。該途徑中的丙酮酸和草酰乙酸是氨基酸合成的重要前體物質(zhì)，氨基酸的合成對其需求量很大，該結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌的代謝特點(diǎn)是能夠高效利用碳源合成氨基酸和蛋白質(zhì)，因此，該菌種利于發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)胞蛋白。
　　對△bglC菌株和△bglH菌株與野生型菌株的代謝通量進(jìn)行了對比分析。通過基因工程手段，分別構(gòu)建了bg

6、lC和bglH基因的敲除菌株△bglC和△bglH。對比△bglC菌株和△bglH菌株與野生型菌株的代謝通量，發(fā)現(xiàn)△bglC和△bglH菌株的磷酸戊糖途徑通量明顯增高，三羧酸循環(huán)加快，回補(bǔ)途徑減慢，同時(shí)，氧氣轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP速度加快，說明代謝過程中呼吸作用加快，耗氧量增加，菌體代謝消耗更多的ATP。這些變化是由基因敲除引起的，敲除后不僅缺失了原來的基因，同時(shí)引入了一個(gè)抗性基因，可能會(huì)造成氨基酸的合成有一定變化。磷酸戊糖途徑通量增高產(chǎn)生大量的