HBV CCCdna形成過程中rcDNA負鏈冗余序列去除部位研究.pdf

1、HBV感染是世界范圍的公共衛(wèi)生問題，我國尤為嚴重。目前，無論是長效干擾素的應(yīng)用，抑或新型核苷類似物均不能有效清除體內(nèi)持久存在的HBV cccDNA。徹底清除cccDNA需要新的策略，而理解和闡明HBV cccDNA形成機制是尋找根除HBV感染方法的必要前提。對比HBV rcDNA與HBV cccDNA基因組結(jié)構(gòu)可知，在HBV cccDNA分子形成中，必不可少的一個環(huán)節(jié)是船V rcDNA負鏈5’端或3’端冗余序列被去除，進而形成閉合的環(huán)狀

2、DNA分子，我們將集中研究此環(huán)節(jié)，試圖解析出冗余序列的去除機制。
　　目的：
　　解析在HBV rcDNA形成HBV cccDNA過程中，負鏈冗余序列5’r和3’r被去除的部位，探索HBV cccDNA形成的分子機制。
　　方法：
　　1、構(gòu)建C1826A定點突變的HBV DNA表達質(zhì)粒，并構(gòu)建含C1826A突變的HBV穩(wěn)定復(fù)制細胞系。
　　2、建立HBV rcDNA正鏈及HBV cccDNA特異性擴增方法

3、。
　　3、建立基于PCR技術(shù)的定點突變位點檢測方法，通過方法學比較做出方法學評價。
　　4、TA克隆含nt1826位點的HBV rcDNA正鏈擴增片段，菌液PCR檢測樣本，計算突變型和野生型比率。
　　5、TA克隆含nt1826位點的HBV cccDNA片段，菌液PCR檢測樣本，計算突變型和野生型比率。
　　6、綜合分析，解析在HBV cccDNA形成過程中，HBV rcDNA負鏈冗余序列去除部位及機制。

4、>　　結(jié)果：
　　1、ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清HBsAg、Real-time PCR及SouthernBlot檢測細胞內(nèi)提取病毒DNA，結(jié)果均顯示穩(wěn)定細胞系能夠正常復(fù)制HBV DNA；且細胞基因組DNA片段測序分析表明含有C1826A突變。
　　2、5’端含外源序列的單引物PCR延伸，產(chǎn)物純化，再以外源序列和上游引物組合PCR能夠特異擴增含nt1826位的HBV rcDNA正鏈片段。
　　3、跨負鏈5’及3’末端間隙

5、之上下游引物可特異擴增HBVcccDNA。
　　4、TA克隆含nt1826位堿基的HBV rcDNA正鏈片段，菌液PCR檢測樣本，其中nt1826位野生型(C)比率為83％-99％，突變型(A)比率為1％-17％。
　　5、TA克隆含nt1826位堿基的HBV cccDNA片段，菌液PCR檢測樣本，其中nt1826位野生型(C)比率為43％-69％，突變型(A)比率為31％-57％。
　　結(jié)論：
　　1、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

6、含C1826A突變的HBV DNA細胞系支持HBV復(fù)制，可作為后續(xù)研究工具。
　　2、成功建立了HBV rcDNA正鏈及HBV cccDNA特異性擴增方法。
　　3、建立了基于PCR技術(shù)的突變位點檢測方法，其可有效區(qū)分并反映定點突變堿基情況。
　　4、在pgRNA逆轉(zhuǎn)錄HBV rcDNA過程中，至少多數(shù)正鏈的合成以5’r為模板，且一直延伸至其末端。
　　5、在HBV cccDNA形成過程中，至少多數(shù)HBV rcD