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文檔簡介
1、目的:采用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞(CFs)建立增殖模型,探討槲皮素對TNF-α誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞(CFs)增殖及P38MAPK、HMGB1表達(dá)的影響,探索槲皮素抑制心肌纖維化的分子機(jī)制,為槲皮素逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)及其開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:1.原代心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定:通過胰蛋白酶消化法,利用差速貼壁法獲得較純化的心肌成纖維細(xì)胞,用光學(xué)顯微鏡和免疫熒光法鑒定細(xì)胞。2.檢測方法:應(yīng)用MTT法檢測
2、心肌成纖維細(xì)胞的增殖,采用Western Blot法測定P38MAPK、HMGB1蛋白的表達(dá)。3.實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)藥物濃度的不同,將第3或4代心肌成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),并將實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分:第一:槲皮素對基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌成纖維細(xì)胞的影響,分為五組:空白對照組以及不同濃度的槲皮素組(25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L);第二:探索TNF-α誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的濃度范圍及作用時(shí)間,根據(jù)不同濃度的TNF-
3、α分為空白對照組、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml組作用8小時(shí),找到濃度范圍后再作用不同的時(shí)間0h、4h、8h、16h、32h;第三:觀察槲皮素對TNF-α誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及P38MAPK、HMGB1表達(dá)的影響,分為6組:空白對照組、TNF-α組、不同濃度的槲皮素(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)+TNF-α
4、組、P38MAPK抑制劑(SB203580)+TNF-α組。
結(jié)果:1.原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過光學(xué)顯微鏡和免疫熒光法鑒定為心肌成纖維細(xì)胞,純度在98%以上。2.槲皮素對基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌成纖維細(xì)胞干預(yù)24h后并不影響心肌成纖維細(xì)胞的增殖,結(jié)果顯示槲皮素各濃度組(25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L)與空白對照組的OD值比較,P>0.05,未見顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.TNF-α各濃度組與對照組比較,其中
5、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml濃度組OD值明顯高于對照組,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α不同時(shí)間組與0h組比較,4h、8h組的OD值高于0h組,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.槲皮素干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞24h后,各濃度組OD值與TNF-α組相比較,P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著槲皮素濃度的增加,CFs的OD值越小;槲皮素各濃度組之間比較,P<0.05,差
6、異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.TNF-α組P38MAPK、HMGB1的蛋白表達(dá)明顯高于對照組、槲皮素各濃度組以及SB203580組(P<0.05),而槲皮素各濃度組(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L),隨濃度的增加,P38MAPK、HMGB1的蛋白表達(dá)逐漸減弱,且組間比較均有差異(P<0.05),SB203580組P38MAPK、HMGB1的蛋白表達(dá)也明顯弱于TNF-α組。
結(jié)論:1.TNF-α在一定濃度、時(shí)間范
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