動(dòng)脈斑塊內(nèi)骨橋蛋白靶向的超聲-熒光雙模態(tài)納米探針的制備及應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景：
　　心血管疾病為危害人類健康的第一殺手，2015年中國心血管病報(bào)告顯示，腦血管疾病及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病死亡率分別居我國居民疾病死亡構(gòu)成首位及第二位，這兩種疾病均與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切。動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊極易在各種誘因誘導(dǎo)下觸發(fā)急性心血管事件，其發(fā)病急，病情進(jìn)展迅速，院外患者常因未能得到及時(shí)診治遺留不可逆性器官損傷，嚴(yán)重降低公眾生存質(zhì)量。因此，急性心血管事件的預(yù)防成為亟待解決的公眾健康難題。當(dāng)前臨床主要采用 CT

2、CA及介入造影從解剖學(xué)角度評(píng)價(jià)動(dòng)脈管腔狹窄程度，評(píng)估斑塊風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)臨床治療。通常臨床診療以血管狹窄超過75％作為手術(shù)干預(yù)節(jié)點(diǎn)，而尸檢結(jié)果顯示，多數(shù)急性梗塞由管腔狹窄小于50%的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊引起。因此，傳統(tǒng)的基于血管解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的診療手段并不能高效的預(yù)估斑塊風(fēng)險(xiǎn)。新興的分子影像學(xué)技術(shù)從病理生理學(xué)角度出發(fā)，在分子生物學(xué)水平對(duì)生物體內(nèi)環(huán)境變化進(jìn)行識(shí)別和量化，近年來在更加精細(xì)化的診斷及治療中呈現(xiàn)出不錯(cuò)的應(yīng)用前景。
　　分子影像學(xué)探針主要

3、由特異的靶向性分子及成像材料構(gòu)成。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種磷酸化糖蛋白，研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生時(shí)，斑塊成分泡沫細(xì)胞和表型轉(zhuǎn)換的平滑肌細(xì)胞中OPN表達(dá)均明顯上調(diào)。而泡沫細(xì)胞形成的巨大壞死物核心和薄纖維帽均為易損斑塊極強(qiáng)的預(yù)測(cè)因素之一，因此OPN有希望作為有效的靶點(diǎn)識(shí)別不穩(wěn)定斑塊。高聚物材料由于毒性小、可修飾性佳，近年來在生物工程領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。液態(tài)氟碳類材料具有優(yōu)良的穩(wěn)定性及攜氧能力，由于其密度大，可通過聚集效

4、應(yīng)實(shí)現(xiàn)超聲造影。
　　本研究以 OPN為靶點(diǎn)，以包裹液態(tài)氟碳全氟溴辛烷(perfluorooctyl bromide,PFOB)的高聚物聚乳酸(poly lactic acid,PLA)納米顆粒作為超聲對(duì)比劑，于抗體上標(biāo)記熒光染料Cy5.5,構(gòu)建靶向OPN的超聲/熒光雙模態(tài)納米探針，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)不穩(wěn)定斑塊的識(shí)別，從而為臨床急性心血管事件的評(píng)估與預(yù)防提供新思路。
　　研究目的：
　　構(gòu)建 OPN靶向的超聲/熒光雙模態(tài)納米探

5、針 Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB，驗(yàn)證納米探針的敏感性、特異性及雙模態(tài)成像能力，并對(duì)探針的穩(wěn)定性及細(xì)胞生物相容性進(jìn)行評(píng)估。
　　研究方法：
　　1.以乳化溶劑揮發(fā)法制備包裹PFOB的PLA納米顆粒,5000g離心5min收集沉淀。以NHS和EDC作為催化劑，在MES緩沖液中活化納米顆粒表面羧基，PBS緩沖液中與聚乙二醇衍生物NH2-PEG-mal通過氨基羧基反應(yīng)對(duì)納米顆粒進(jìn)行親水性修飾。以還原劑 T

6、CEP打開抗體二硫鍵暴露巰基，與聚乙二醇尾端的馬來酰亞胺基通過點(diǎn)擊反應(yīng)偶聯(lián)，得到 Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB。通過透射電鏡、紅外光譜、動(dòng)態(tài)光散射儀、熒光光度計(jì)對(duì)納米顆粒進(jìn)行表征，乳膠管水浴超聲觀察納米顆粒的成像能力。
　　2.以 RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞系及 MOVAS小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞系作為細(xì)胞模型，通過氧化低密度脂蛋白孵育，模擬動(dòng)脈粥樣硬化斑塊成分，在細(xì)胞水平觀察OPN的表達(dá)變化。以不同濃

7、度的材料與細(xì)胞共孵育，探究所構(gòu)建納米顆粒的生物學(xué)毒性。將納米探針與泡沫細(xì)胞共孵育，觀察納米探針的體外尋靶能力，分別設(shè)加入靶向OPN納米顆粒的實(shí)驗(yàn)組、同時(shí)加入靶向納米顆粒和大量OPN抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制組、連接非特異性抗體的IgG納米顆粒組。
　　3.以高脂飼料喂養(yǎng)的 ApoE-/-敲除小鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，通過大體解剖及組織病理切片染色對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行鑒定。通過對(duì)連續(xù)病理切片的 OPN、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物 CD68及平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α

8、-SMA免疫組織化學(xué)染色，觀察斑塊組織中OPN與巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分布的一致性。將標(biāo)記染料的靶向抗體注射入小鼠體內(nèi)，觀察標(biāo)記抗體對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的識(shí)別能力。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB納米探針。經(jīng)5000g離心優(yōu)選后納米顆粒粒徑分布較均一，水合粒徑在320nm至400nm之間，Zeta電位為-20.14±0.68mv。透射電鏡觀察PLA納米顆粒，可見顆粒呈類圓

9、形，多數(shù)顆粒粒徑在200nm左右，表面光滑，未見明顯的團(tuán)聚及粘連現(xiàn)象。乳膠管超聲成像示PLA納米顆粒在PIHI模式下顯示為點(diǎn)狀密集高回聲，在較高機(jī)械指數(shù)下信號(hào)無衰減。在光譜結(jié)果見Cy5.5的發(fā)射波長約為705.7nm。
　　2.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示經(jīng)低密度脂蛋白處理后OPN表達(dá)明顯增加。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示納米顆粒在使用范圍無顯著細(xì)胞毒性。當(dāng)探針濃度達(dá)到0.5mg/ml時(shí)，細(xì)胞活性仍大于80%。激光共聚焦顯微鏡下觀察所構(gòu)建納米探針在

10、泡沫細(xì)胞模型中的攝取情況，熒光半定量結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組OPN NPs攝取量顯著高于競(jìng)爭(zhēng)抑制組及無關(guān)對(duì)照組，探針靶向識(shí)別性能佳。
　　3.大體解剖見在血管分叉處、血流剪切應(yīng)力改變顯著的部位較易形成斑塊。組織病理切片染色顯示斑塊內(nèi)大量脂質(zhì)沉積、壞死核心形成、纖維帽薄，免疫組織化學(xué)染色顯示OPN在斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分布區(qū)域均有多量表達(dá)。標(biāo)記抗體的在體熒光成像結(jié)果表明，OPN抗體較IgG抗體熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，靶向性良好。研究結(jié)論：