Profilin-1靶向的多模態(tài)納米探針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的分子影像研究.pdf

1、研究背景:
　　隨著人類生活水平和飲食習(xí)慣的改變,心血管疾病已成為威脅人類健康的重大疾病之一,具有高發(fā)病率和高致死率的特點(diǎn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球2008年心血管疾病的死亡率占所有致死因素的30％左右。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè),到2020年心血管疾病將成為全世界的第一死因。而大量的研究證明,動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊所導(dǎo)致的斑塊破裂、血栓形成和血管阻塞是引起急性心血管事件的主要因素。雖然隨著研究的不斷深入,動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的預(yù)防和治療已形成很多的共

2、識(shí),包括生活方式的干預(yù)、藥物治療、介入治療和外科手術(shù)治療等。但是由于易損斑塊具有隱匿性和破裂的突發(fā)性等特點(diǎn),其所導(dǎo)致的急性臨床事件仍然居高不下。因此,如何實(shí)現(xiàn)對(duì)易損斑塊形態(tài)和成分性質(zhì)的早期診斷,并進(jìn)行積極有效的干預(yù)是心血管研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。
　　近年來(lái)蓬勃發(fā)展的分子影像技術(shù),區(qū)別與傳統(tǒng)的影像技術(shù),它能夠從組織和細(xì)胞水平反映疾病的病理形成過(guò)程,為實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的結(jié)構(gòu)和成分變化提供了有效的工具,同時(shí)還可以用

3、于判斷預(yù)防和治療的效果。特異性的分子成像探針的構(gòu)建和制備對(duì)于疾病的分子影像診斷至關(guān)重要,是提高成像的特異性和敏感度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而合成分子探針首先必須選擇合適的成像靶點(diǎn),在目前的研究中,成像靶點(diǎn)大多選擇在病理?xiàng)l件下,高表達(dá)或特異性表達(dá)的物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、抗原、肽類、受體和特異性酶等生物分子,或者是需要成像追蹤的靶細(xì)胞。
　　前纖維蛋白(profilin)是一類的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族,其中profilin-1廣泛存在于真核細(xì)胞,參與調(diào)

4、控肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚合的過(guò)程。近年來(lái)的多項(xiàng)研究證實(shí),profilin-1的表達(dá)與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。尤其是它可通過(guò)調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展,有望成為診斷和干預(yù)斑塊形成發(fā)展的生物標(biāo)志物。
　　在確定合適的靶點(diǎn)以后,還需要選擇生物相容性好,細(xì)胞毒性小和在體內(nèi)滯留時(shí)間合適的載體。超順磁性的氧化鐵納米顆粒(Super Paramagnetic Iron Oxide,SPIO)體積小,直徑

5、不超過(guò)30 nm,只有少部分被肝、脾的單核吞噬細(xì)胞所吞噬,半衰期更長(zhǎng),并最終可被生物降解,是目前常用于MRI成像的最重要對(duì)比劑之一。
　　因此,本研究擬利用profilin-1作為分子探針的靶點(diǎn),DMSA-Fe3O4 nanoparticles為載體,構(gòu)建靶向profilin-1的MRI/Optical(磁共振/光學(xué))多模態(tài)納米探針,用于評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的性質(zhì)以及藥物治療的效果,為實(shí)現(xiàn)易損斑塊的分子影像早期診斷提供理論依據(jù)和實(shí)

6、驗(yàn)證據(jù)支持。
　　研究目的:
　　1.建立ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型,明確profilin-1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)水平以及與平滑肌細(xì)胞的關(guān)系。體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞,從細(xì)胞水平闡明profilin-1的表達(dá)與平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的關(guān)系以及可能機(jī)制。
　　2.采用化學(xué)合成法構(gòu)建靶向profilin-1的MRI/optical多模態(tài)納米探針(profilin-1-Cy5.5-DMSA-Fe3O4-NPs),并明

7、確探針的表征、毒性、生物相容性和在體內(nèi)組織器官中的生物學(xué)分布。
　　3.利用熒光成像和MRI分別從細(xì)胞水平和在體水平觀察探針在斑塊內(nèi)的分布,并進(jìn)行組織學(xué)定量分析驗(yàn)證,通過(guò)活體成像觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的負(fù)荷和性質(zhì)。
　　研究方法:
　　1.選取體重為20g左右的雄性ApoE-/-小鼠,給予高脂高膽固醇喂養(yǎng)(飼料包含15%的脂肪和0.25%膽固醇)。16周后取血管分別進(jìn)行油紅和HE染色,驗(yàn)證是否成功構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型。<

8、br>　　2.將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組,分別為:
　　(1)對(duì)照(C57小鼠)組,給予普通飼料喂養(yǎng);
　　(2)高脂高膽固醇喂養(yǎng)(HFD,high fat diet)組,給予高脂高膽固醇喂養(yǎng);
　　(3)HFD+Atorvastatin干預(yù)組:高脂高膽固醇喂養(yǎng)16周同時(shí)給予Atorvastain干預(yù)。
　　16周后,取血檢測(cè)甘油三酯TG,總膽固醇TC,低密度脂蛋白LDL-C和高密度脂蛋白HDL水平的變化。

9、取血管組織分別進(jìn)行油紅和HE染色。免疫熒光染色檢測(cè)profilin-1蛋白在斑塊局部的表達(dá)和分布以及與平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的共定位。Western blot檢測(cè)進(jìn)一步明確profilin-1蛋白在血管壁的表達(dá)水平。
　　3.培養(yǎng)鑒定小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞系(MOVAS),分為以下4組:
　　(1)對(duì)照組;
　　(2)profilin-1 siRNA(4μg)預(yù)處理組;
　　(3)oxLDL(20μg/ml)

10、預(yù)處理組;
　　(4) ox-LDL(20μg/ml)+profilin-1 siRNA(4μg)預(yù)處理組。
　　CCK-8檢測(cè)平滑肌細(xì)胞的增殖,transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移。采用免疫熒光和Western blot檢測(cè)細(xì)胞胞漿內(nèi)profilin-1蛋白的表達(dá)情況。利用Western blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。
　　4.采用化學(xué)合成法制備二巰基丁二酸四氧化三鐵磁性納米顆粒(2,3-dimercapt

11、osuccinnic acid-Fe3O4 magnetic nanopartilces,DMSA-Fe3O4-NPs),NHS活化 DMSA-Fe3O4-NPs。在 EDC螯合劑作用下連接上 profilin-1抗體和NHS-Cy5.5,構(gòu)建靶向 proflin-1的MRI/optical多模態(tài)納米探針（PF1-Cy5.5-DMSA-Fe3O4-NPs)。透射電鏡、馬爾文粒徑分析、zeta電位檢測(cè)和飽和磁化強(qiáng)度測(cè)量對(duì)DMSA-Fe3O

12、4-NPs進(jìn)行表征。
　　5.單核巨噬細(xì)胞(RAW364.7)吞噬實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)比較DMSA-Fe3O4-NPs與普通的Fe3O4-NPs在生物相容性和細(xì)胞毒性方面的區(qū)別。紫外分光光度分析profilin-1抗體是否成功偶聯(lián)上DMSA-Fe3O4-NPs。結(jié)合BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量檢測(cè)和鄰二氮菲分光光度法的結(jié)果分析抗體與納米顆粒的偶聯(lián)效率。利用熒光觀察PF1-Cy5.5-DMSA-Fe3O4-NP

13、s探針在小鼠體內(nèi)各組織器官的分布和代謝過(guò)程。
　　6.給各組小鼠尾靜脈注射入 PF1-Cy5.5-DMSA-Fe3O4-NPs,采用9.4T小動(dòng)物 MRI對(duì)斑塊的形態(tài)和性質(zhì)進(jìn)行成像,根據(jù)T2 WI的信號(hào)變化半定量分析斑塊局部探針聚集的含量。利用組織學(xué)分析進(jìn)一步的檢測(cè)探針在斑塊中的聚集情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.給予ApoE-/-小鼠高脂高膽固醇喂養(yǎng)16周后,小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建成功。
　　2.血脂檢測(cè)的結(jié)

14、果提示:與對(duì)照組相比,小鼠血漿中 LDL和TC水平明顯上升,HDL水平顯著降低。給予Atorvastatin治療可顯著降低LDL和TC的水平,卻不能明顯改變 HDL水平。免疫熒光染色的結(jié)果顯示 profilin-1在斑塊中的表達(dá)明顯增加,并且與血管平滑肌細(xì)胞分布的位置基本一致。Western blot檢測(cè)也提示與對(duì)照組相比,斑塊組血管壁中profilin-1蛋白的表達(dá)明顯增加。
　　3.Ox-LDL預(yù)處理可促進(jìn)MOVAS細(xì)胞的增殖

15、、遷移和胞內(nèi)profilin-1蛋白的表達(dá)。給予profilin-1 siRNA干預(yù),可抑制ox-LDL對(duì)MOVAS細(xì)胞的上述作用。Western blot檢測(cè)顯示ox-LDL(20μg/ml)干預(yù)可顯著增加VSMCs中profilin-1蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)MEK和ERK兩個(gè)蛋白的磷酸化水平也明顯增加。而給予profilin-1 siRNA的干預(yù)后,不僅可以抑制 VSMCs中 profilin-1的表達(dá),還減弱了 MEK和ERK蛋白的

16、磷酸化水平。
　　4.透射電鏡的結(jié)果提示:DMSA-Fe3O4-NPs顆粒結(jié)構(gòu)基本是類球形,大小均一,無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象。馬爾文粒徑和zeta電位分析的結(jié)果:DMSA-Fe3O4-NPs平均尺寸為8 nm,表面攜帶負(fù)電荷,zeta電位為-42.7nm,顆粒溶液的穩(wěn)定性較好。飽和磁化強(qiáng)度曲線顯示DMSA-Fe3O4-NPs為超順磁性的納米材料,飽和磁化強(qiáng)度為56.4 emu/g,適合作為MRI探針的載體。細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)證實(shí)巨噬細(xì)胞(RAW36

17、4.7)吞噬DMSA-Fe3O4-NPs的數(shù)目明顯少于普通Fe3O4-NPs。而MTT實(shí)驗(yàn)提示與普通Fe3O4-NPs相比,DMSA-Fe3O4-NPs對(duì)細(xì)胞的毒性作用明顯降低。
　　5.紫外分光光度分析結(jié)果證實(shí)profilin-1抗體已成功螯合到DMSA-Fe3O4-NPs上。BCA蛋白定量檢測(cè)和鄰二氮菲分光光度法的結(jié)果分析則顯示在pH=8的反應(yīng)體系中,抗體的連接效率最高可達(dá)到78.6%。MOVAS細(xì)胞體外熒光實(shí)驗(yàn)提示與其他組相

18、比,ox-LDL預(yù)處理組的細(xì)胞表面結(jié)合靶向profilin-1的探針數(shù)量最多。
　　6.給予各組小鼠尾靜脈注射探針,36小時(shí)后9.4T MRI成像結(jié)果顯示與其他組相比,斑塊組 T2加權(quán)像的信號(hào)明顯降低。斑塊組織切片普魯士藍(lán)染色證實(shí)斑塊組血管壁局部聚集的靶向profilin-1的探針數(shù)量最多,與其他組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究結(jié)論:
　　1.Profilin-1與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程密切相關(guān),可通過(guò)激活profil