熒光納米探針及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備與在胃癌靶向成像與治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、在中國，胃癌發(fā)病率位于第二位，死亡率位于第三位。全球每年新發(fā)胃癌100余萬，死亡約80萬，中國每年新發(fā)胃癌占全球的42％，死亡占35％，其發(fā)病率和死亡率均是世界平均水平兩倍多。胃癌起源于胃壁最表層的粘膜上皮細(xì)胞，可發(fā)生于胃的各個部位，可侵犯胃壁的不同深度和廣度，癌灶局限在粘膜內(nèi)或粘膜下層的稱為早期胃癌。早期胃癌經(jīng)足夠的治療后90％以上患者能生存5年以上或治愈，晚期胃癌患者治療后5年生存率不足5％。因此，早發(fā)現(xiàn)是改善療效、提高生存率的關(guān)鍵

2、，但是我國胃癌患者在確診時為早期者僅占10％以下。所以，胃癌的早期診斷與治療是提高胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。納米技術(shù)和干細(xì)胞技術(shù)是繼手術(shù)、化療和放療之外新興的治療腫瘤的新技術(shù)，充分利用這兩種技術(shù)的優(yōu)勢，不但可以發(fā)現(xiàn)體內(nèi)胃癌，而且可以同時實現(xiàn)腫瘤的靶向治療，從而提高早期胃癌的診斷率和增強(qiáng)治療效果。
　　 本論文結(jié)合現(xiàn)代分子影像技術(shù)和分子靶向技術(shù)，制備了熒光納米探針和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并探索了在胃癌靶向診療中應(yīng)用的可行性，主要研究工作包括以

3、下四個方面:
　　 (1)通過反微乳液法制備熒光磁性納米粒子，采用MTT、蛋白質(zhì)印跡和病理組織分析等方法評價了熒光磁性納米粒子的生物安全性，通過共價鍵偶聯(lián)胃癌組織高表達(dá)的分子標(biāo)志物BRCAA1的單克隆抗體制備出熒光磁性納米探針，利用分子影像技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和等離子體質(zhì)譜技術(shù)共同表征納米探針在體內(nèi)的分布及靶向胃癌能力。結(jié)果表明:熒光磁性納米粒子具有良好熒光性能和磁響應(yīng)性能，對細(xì)胞的毒性劑量為50μg/mL，對小鼠的毒性劑量為5m

4、g/kg·bw，在毒性劑量范圍內(nèi)FMNPs具有良好的生物相容性;制備的熒光磁性納米探針通過尾靜脈注射后在1h內(nèi)可靶向到體內(nèi)直徑為5mm大小的皮下腫瘤組織處，6h后在腫瘤組織處達(dá)到信號峰值;該納米探針對胃癌具有良好的靶向特異性和檢測靈敏度，為胃癌的早期檢測和診斷奠定基礎(chǔ)。
　　 (2)采用生物分子RNaseA作為模板輔助合成熒光量子點，通過共價鍵偶聯(lián)胃癌組織高表達(dá)的分子標(biāo)志物HER2單克隆抗體制備出量子點探針，通過原位移植腫瘤組織

5、塊的方法建立生物發(fā)光的胃癌原位移植模型，利用活體熒光成像觀察納米探針在模型鼠體內(nèi)的分布，并通過生物發(fā)光成像檢測模型鼠原位胃癌的生長情況，最后提出納米探針抑制腫瘤生長的機(jī)理。結(jié)果表明:制備的量子點探針在體內(nèi)主要分布在腫瘤組織、肝部和肺部，該探針對原位胃癌組織具有顯著的靶向特異性和檢測靈敏度，在尾靜脈注射后6h就可以清楚地在直徑2mm左右的腫瘤組織處檢測到熒光信號;并且該納米探針可以顯著地抑制腫瘤的生長，延長小鼠的生存時間，其可能的抑制機(jī)理

6、是RNaseA破環(huán)細(xì)胞的mRNA，阻斷蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。該探針在診斷和治療早期胃癌研究中具有應(yīng)用前景。
　　 (3)利用近紅外熒光染料DiR標(biāo)記小鼠胚胎干細(xì)胞，通過活體成像系統(tǒng)觀察小鼠胚胎干細(xì)胞在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布，通過組織免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)驗證小鼠胚胎干細(xì)胞靶向胃癌組織的能力，并通過流式細(xì)胞分析實驗，ELISA實驗和細(xì)胞穿膜實驗提出小鼠胚胎干細(xì)胞靶向胃癌的可能性機(jī)理。結(jié)果顯示:小鼠胚胎干細(xì)胞在尾靜脈注射

7、進(jìn)入荷瘤小鼠體內(nèi)10min后就可以識別出胃癌組織，2h后在胃癌組織中聚集的細(xì)胞量達(dá)到峰值;小鼠胚胎干細(xì)胞遷移胃癌組織的可能性機(jī)理是胃癌組織周圍分泌趨化因子CXCL12，從而誘導(dǎo)表達(dá)CXCR4的小鼠胚胎干細(xì)胞向腫瘤組織趨化運動。mES細(xì)胞靶向體內(nèi)胃癌的現(xiàn)象為利用干細(xì)胞診斷和治療胃癌提供新的研究方向。
　　 (4)建立人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，利用己制備的熒光磁性納米粒子標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞制各出干細(xì)胞納米探針，通過熒光成像系統(tǒng)觀察干細(xì)胞

8、納米探針在荷瘤小鼠體內(nèi)示蹤胃癌的能力，并在63kHz，7kA/m的外加交變磁場作用下，通過量取腫瘤的體積評價干細(xì)胞納米探針抑制腫瘤細(xì)胞生長的情況。結(jié)果顯示:通過慢病毒載體遞送Oct4、Sox2、Nanog和Lin28因子，成功地誘導(dǎo)HDF細(xì)胞重組為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞;利用熒光磁性納米粒子標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞成功制備了具有良好熒光性能的干細(xì)胞納米探針;制備的干細(xì)胞納米探針具有好的靶向識別胃癌的能力;干細(xì)胞納米探針主要分布在體內(nèi)的腫瘤組織和肝