HBV cccDNA熒光定量檢測方法的建立與新型核苷類抗乙肝病毒化合物體外篩選.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染導(dǎo)致乙型肝炎的發(fā)生,嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。目前的治療藥物存在毒副作用大、價(jià)格昂貴、不能完全清除病毒且易產(chǎn)生耐藥性等諸多問題。因此,尋找新型的抗HBV藥物,成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為,HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA,cccDNA)是乙肝病毒復(fù)制的第一中間體,是HBV存在和持續(xù)復(fù)制的根本原因。因此,開展對HBV ccc

2、DNA的定量檢測,對于判斷HBV在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的狀況具有重要的意義,使之能夠更準(zhǔn)確的評價(jià)抗HBV藥物的療效。本文首先建立了一種HBV cccDNA SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法;然后應(yīng)用HepG2.2.15細(xì)胞株,采用MTT、ELISA和熒光定量PCR檢測方法,對60種新型核苷類化合物進(jìn)行初步體外篩選,力求獲得低毒、高效的抗HBV候選藥物。第一部分;HBV cccDNA熒光定量檢測方法的建立。[目的]建立一種穩(wěn)定、特異

3、、敏感的HBV cccDNA SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法。[方法]根據(jù)HBV松弛環(huán)狀DNA(relax drcular DNA,rcDNA]與cccDNA的結(jié)構(gòu)差異,設(shè)計(jì)跨越雙缺口的特殊引物,并利用一種ATP依賴不降解質(zhì)粒的DNA酶(Plasmid-SafeTM ATPdependent Dnase,PSAD)提高反應(yīng)的特異性;建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行特異性、敏感性和重復(fù)性檢驗(yàn)。應(yīng)用所建立的方法評價(jià)拉米夫定

4、和阿德福韋酯對HBV cccDNA的抑制效果。[結(jié)果]該方法能特異性檢測到HBV cccDNA,在2.68×108～2.68×103copies/μl檢測范圍之間有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為-1.00,擴(kuò)增效率為102％;最低檢測限為2.68×101copies/μl。拉米夫定和阿德福韋酯對HBV cccDNA均有很好的抑制效果。[結(jié)論]該實(shí)驗(yàn)所建立的方法穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性好、靈敏度高,可快速定量檢測HBV cccDNA,用于抗HBV藥物

5、的評價(jià)。
　　 第二部分:抗HBV化合物體外篩選研究。[目的]從60種新型核苷類化合物中篩選出具有體外抗HBV活性的新型化合物。[方法]選用拉米夫定(3TC)作為陽性藥物,通過MTT法檢測受試樣品對HepG2.2.15細(xì)胞的毒性,ELISA法檢測樣品作用后第3、6、9天細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的變化,以細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(CC50)、半數(shù)抑制濃度(IC50)、治療指數(shù)TI(CC50/IC50)為指標(biāo),對60個(gè)受試樣品進(jìn)

6、行初篩,篩選出具有體外抗HBV活性的樣品,然后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測活性樣品對HBV DNA和HBV cccDNA含量的影響,從而對樣品的抗HBV活性做出進(jìn)一步的評價(jià)。[結(jié)果](1)對60個(gè)受試樣品進(jìn)行初篩,共篩出13個(gè)樣品的CC50值大于3TC(858.71μM)。(2)針對毒性較低的13個(gè)受試樣品,根據(jù)毒性測定結(jié)果設(shè)定合適的篩選濃度,結(jié)果顯示核苷類化合物GL110030、GL110054對HBsAg和HBeAg的分泌具有較強(qiáng)的

7、抑制作用,用藥9天的治療指數(shù)均遠(yuǎn)大于10.0。(3)核苷類化合物GL110030、GL110054在1μM、0.1μM、0.01μM時(shí),顯著影響HepG2.2.15細(xì)胞上清中的HBV DNA含量,平均抑制率分別為76.06%、62.15%、54.87%及77.01%、68.68%、53.56%;同時(shí),對HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA含量也均產(chǎn)生顯著影響,其平均抑制率分別為61.92%、51.80%、36.48%和68.00%

8、、60.47%、38.14%。(4)GL110030、GL110054對HcpG2.2.15細(xì)胞內(nèi)cccDNA拷貝數(shù)有明顯影響,在1μM、0.1μM、0.01μM時(shí),細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA含量分別為0.59±0.2×103、3.02±0.43×103、6.06±1.46×103copies/μl及0.56±0.11×103、2.34±0.97×103、5.21±0.87×103copies/μl;與正常對照組13.78±0.78×1

9、03 copies/μl相比,其含量有明顯的下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。[結(jié)論]對60個(gè)受試樣品進(jìn)行初篩,得出對HepG2.2.15細(xì)胞具有較低毒性的樣品共13個(gè),其中GL110030、GL110054能顯著抑制乙肝病毒抗原、HBV DNA及HBV cccDNA,在體外具有低毒高效的抗HBV作用,有望成為抗HBV的候選藥物。
　　 第三部分:結(jié)論。概括敘述了本課題的主要研究成果及意義。
　　 第四部分:文獻(xiàn)