SNX10、SNX11蛋白功能研究.pdf

1、內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運是真核調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的一個重要手段。蛋白需要通過內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運在適當?shù)臅r間定位到適當?shù)膮^(qū)域以發(fā)揮它正常的生理功能。同時內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運也可以通過修飾和降解等方法調(diào)節(jié)蛋白的活性。Sorting Nexins(SNXs)是一個新的與內(nèi)涵體分選相關蛋白家族。它們以PX結構域為特征結構。PX結構域是個磷酸肌醇結合結構域，SNXs通過PX與磷酸肌醇的結合定位到內(nèi)涵體膜上。由于SNXs在除PX結構域外的蛋白結構上較大的差異，這些成員在多樣的內(nèi)涵體轉(zhuǎn)

2、運通路上發(fā)揮功能。
　　 SNX10，SNX11是SNXs家族結構最簡單的一類蛋白，除了PX結構域外不含有其它已知的功能性結構域。這兩個蛋白在氨基酸序列具有很高的相似性，在進化上也最為接近。但它們的功能完全未知。我們實驗室第一次發(fā)現(xiàn)在細胞中高表達SNX10可以誘導出巨大的空泡結構，但對這個過程的分子機制并不清楚。我們發(fā)現(xiàn)SNX10主要定位在Rab5陽性的早期內(nèi)涵體上，而誘導出的空泡則顯示出晚期內(nèi)涵體標記，說明SNX10可能開啟了

3、一條通路，加速了由早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)變。而在這個過程中抑制Rab7可以起到抑制SNX10表型的作用，而Rab5抑制則不產(chǎn)生影響，說明這條通路不依賴于Rab5而依賴于Rab7。同時我們發(fā)現(xiàn)SNX11可以特異性的抑制SNX10的表型。SNX11在早期和晚期內(nèi)涵體上都有部分定位。當SNX11與SNX10一起轉(zhuǎn)染入細胞時，SNX11與SNX10共定位在早期內(nèi)涵體上，并抑制Rab7標記的晚期內(nèi)涵體的擴大。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，V-ATPase

4、參與了SNX10誘導的空泡化。SNX10與V-ATPase的V1D亞基相互作用，由此V-ATPase被異常激活可能是增強的內(nèi)涵體膜融合和酸化的原因。SNX11也與V1D亞基相互作用。SNX11，SNX10對V1D的結合具有競爭關系，并且SNX11表現(xiàn)出更強的親和力。V-ATPase的異常活性也是VacA誘導細胞空泡的原因，我們發(fā)現(xiàn)SNX11也可以抑制VacA誘導的空泡的形成。以上這些結果說明了SNX10，SNX11通過V-ATPase調(diào)

5、節(jié)內(nèi)涵體。
　　 我們進一步在斑馬魚中研究SNX10的生理功能。用morpholino的方法敲降SNX10后，可以破壞斑馬魚的左右不對稱發(fā)育。KV(Kupffer's Vesicle)是決定斑馬魚作用不對稱發(fā)育的重要器官，而KV中纖毛在其發(fā)揮功能的關鍵。我們發(fā)現(xiàn)在注射SNX10 morpholino的胚胎中，KV的纖毛形成受到抑制。體外實驗的結果表明SNX10調(diào)節(jié)細胞的纖毛發(fā)生。SNX10定位在纖毛基體的周圍。負責高爾基體與基體

6、之間膜泡運輸?shù)腞ab11與SNX10表現(xiàn)出部分功定位。與纖毛膜泡轉(zhuǎn)運相關的蛋白BBS4，IFT88也表現(xiàn)出與SNX10的共定位。而用siRNA敲降SNX10可以阻礙細胞中的纖毛形成。因為SNX10/V-ATPase一起調(diào)節(jié)內(nèi)涵體形態(tài)，所以V-ATPase也可能參與對纖毛膜泡運輸?shù)恼{(diào)控。用V1D和Vod1的GFP融合蛋白我們發(fā)現(xiàn)V-ATPase定位在基體上，與纖毛運輸相關的蛋白表現(xiàn)出共定位。在細胞中敲降V-ATPase可以抑制纖毛的形成，

7、而在斑馬魚中敲降V-ATPase則在KV，原腎管，側線等多個器官中造成纖毛缺陷。而且在體內(nèi)和體外實驗中，SNX10和V-ATPase對纖毛的調(diào)節(jié)都表現(xiàn)出協(xié)同作用。這些結果支持SNX10/V-ATPase通過膜泡轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)纖毛發(fā)生的假設。在進一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)V-ATPase在中心體上定位依賴于SNX10，在敲降SNX10的細胞中，V-ATPase在中心體上定位的比例明顯降低。這說明了在這過程中SNX10對V-ATPase的調(diào)節(jié)方式。同

8、時我們也發(fā)現(xiàn)SNX10，V-ATPase的siRNA可以阻止Rab8向纖毛的轉(zhuǎn)運，這一結果從另一側面說明在纖毛發(fā)生過程中SNX10/V-ATPase對膜泡轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)。
　　 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)：
　　 1，SNX10，SNX11調(diào)節(jié)早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)變，這個調(diào)節(jié)是通過V-ATPase來實現(xiàn)的。SNX10和SNX11都與V-ATPase的V1D亞基相互作用，
　　 2，SNX11通過競爭性的與V1D結合來抑