人肝脯氨肽酶基因的克隆表達(dá)及其生化藥理學(xué)性質(zhì).pdf

1、有機(jī)磷化合物如梭曼(Soman)、沙林(Sarin)、塔崩(Tabun)、對(duì)氧磷(Paraoxon)和對(duì)硫磷(Parathion)等是一類不可逆地抑制膽堿酯酶(AchE)的劇毒化合物，主要作為化學(xué)武器或農(nóng)藥使用。對(duì)AchE的不可逆抑制導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能神經(jīng)功能亢進(jìn)可用可逆性AChE抑制劑(如氨基甲酸酯)進(jìn)行預(yù)防，用抗膽堿能藥物對(duì)癥治療及使用肟類藥物使有機(jī)磷化合物抑制的膽堿酯酶重活化。盡管用這些抗毒措施在防治有機(jī)磷化合物中毒時(shí)可免除死亡

2、，但卻不能很有效地控制染毒后的失能狀態(tài)和毒性效應(yīng)。一個(gè)新的有效的辦法是用毒劑水解酶將有機(jī)磷毒劑在其未到達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)靶分子乙酰膽堿酯酶和膽堿受體之前在血流中水解掉。有機(jī)磷酸酸酐水解酶(Organophophorusacidanhydrolase，OPAA)[EC.3.1.8.2]，廣泛存在于原核和真核生物組織中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明肝臟和腎臟中含有豐富的有機(jī)磷化合物水解酶活性，它對(duì)有機(jī)磷化合物的高效催化水解作用已引起人們的極大關(guān)注。 我室

3、王青定分離純化了人肝梭曼水解酶，經(jīng)電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，測(cè)定了其N端10個(gè)氨基酸殘基序列，序列對(duì)比顯示此序列與人肝脯氨肽酶(Prolidase)[E.C.3.4.13.9]N端序列9～18個(gè)氨基酸殘基有90％的同源性，得到的人肝Soman水解酶序列除缺少編碼N末端前8個(gè)氨基酸的核酸序列及編碼的第2個(gè)氨基酸由w變?yōu)镻外，其余均與Prolidase相同。美國(guó)軍事生化防御部鄭篤誠(chéng)等研究發(fā)現(xiàn)，嗜鹽菌交替單胞菌屬(Alteromonas)菌株胞

4、內(nèi)含有高濃度的OPAA，水解Soman和Sarin，此酶氨基酸序列與脯氨肽酶具有較高的同源性，確定兩者由同一祖先的基因進(jìn)化而來(lái)。 本研究以人肝為材料，從中克隆了人肝Prolidase基因，采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建人肝Prolidase三個(gè)不同表達(dá)系統(tǒng)的重組質(zhì)粒，分別在原核表達(dá)系統(tǒng)、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，通過(guò)離子交換層析及凝膠過(guò)濾層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化，并探討了其生化藥理性質(zhì)。主要內(nèi)容如下： 1

5、根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人肝Prolidase核酸序列，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)人肝Prolidase基因的引物。從人肝中提取總RNA，以此RNA反轉(zhuǎn)錄PCR獲得的cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)回收純化，利用PinPoint-T載體順利地克隆了人肝Prolidase基因，大小約1.5kb，基因全序列分析表明獲得的Prolidase基因與報(bào)道序列完全相同。 2將Prolidase基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX4T-1中，

6、構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1-P。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得表達(dá)菌株。IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了人Prolidase基因在大腸桿菌中的表達(dá)，重組蛋白以不溶性包涵體形式存在。凝膠密度掃描分析表明，表達(dá)量約占菌體總蛋白的21％。包涵體經(jīng)分離、變性、復(fù)性等步驟的處理后，產(chǎn)物未顯示酶活性。 3為鑒定其表達(dá)產(chǎn)物是否具有Prolidase活性，將Prolidase基因克隆到酵母穿梭質(zhì)粒pYES2中，構(gòu)建了人Prolidase釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒

7、pYES2-P。將重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到釀酒酵母INVSc1中，將重組子進(jìn)行半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，采用正交試驗(yàn)L9(34)優(yōu)化了重組子w-3誘導(dǎo)表達(dá)條件(溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和接種量)。破碎細(xì)胞上清液的SDS-PAGE分析得到一條56kDa的條帶。密度掃描分析顯示，表達(dá)量占上清液總蛋白的3.16％。1L誘導(dǎo)培養(yǎng)基生產(chǎn)7g濕酵母含重組蛋白4.56mg。以Gly-Pro和Soman為底物測(cè)定酶活，發(fā)現(xiàn)具有較高的Prolidase和OPAA活性。最大比活性

8、分別為226.5和578nmol/min/mg。 4同時(shí)將Prolidase基因克隆到畢赤酵母穿梭質(zhì)粒pPIC9K中，構(gòu)建了人Prolidase畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-P。將線性化重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，得到了兩種重組子：置換型重組子和插入型重組子，將重組子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。采用正交試驗(yàn)L9(34)優(yōu)化了插入型重組子P2＃誘導(dǎo)條件(培養(yǎng)基pH、甲醇濃度和誘導(dǎo)時(shí)間)。SDS-PAGE分析得到一條73kDa

9、的條帶。密度掃描分析顯示，表達(dá)量占上清液總蛋白的55％。1L誘導(dǎo)培養(yǎng)基生產(chǎn)重組蛋白86.2mg。酶活測(cè)定結(jié)果顯示，重組蛋白具有Prolidase和OPAA活性。插入型重組子P2＃中兩種酶的比活性分別為44.1和54.8nmol/min/mg。 5分別對(duì)畢赤酵母插入型重組子P2＃表達(dá)上清液及釀酒酵母重組子w-3表達(dá)菌體破壁上清液中的重組Prolidase進(jìn)行了純化。先后經(jīng)DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱層析