利用反義RNA技術(shù)調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成的研究——CCoAOMT和4CL基因?qū)δ举|(zhì)素生物合成的調(diào)控及C4H啟動(dòng)子的分離與鑒定.pdf

1、摘要木質(zhì)素是一類酚類次生代謝產(chǎn)物,在植物體內(nèi)行使重要的生理功能,但它卻是形成造紙污染的主要來源.利用基因工程手段,在分子水平調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生物合成,降低木質(zhì)素的含量或改變組分以培育適合造紙的植物原料樹種具有較大的應(yīng)用價(jià)值和環(huán)保效益.該研究利用反義RNA技術(shù),主要圍繞木質(zhì)素合成途徑中的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)和4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL)的基因調(diào)節(jié)植物木質(zhì)素的生物合成,研究取得了如下進(jìn)展:1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CCo

2、AOMT和4CL基因的反義表達(dá)載體導(dǎo)入毛白楊中.PCR-Southern、RT-PCR和Western雜交檢測(cè)結(jié)果顯示,兩個(gè)反義基因均已整合到毛白楊基因組DNA上,并在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá).通過分子生物學(xué)檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選,獲得批量轉(zhuǎn)基因植株.Klason木質(zhì)素含量測(cè)定分析表明,抑制內(nèi)源CCoAOMT或4CL基因的表達(dá),均能有效降低轉(zhuǎn)基因植物中的木質(zhì)素含量,且不影響植株正常生長和發(fā)育以及碳水化合物的合成.研究中還發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因毛白楊的莖桿

3、上一些區(qū)域呈紅棕色,顏色的深淺與轉(zhuǎn)基因毛白楊木質(zhì)素含量的下降幅度呈一定的正相關(guān),因此,顏色變化可作為轉(zhuǎn)基因植株篩選的一個(gè)輔助指標(biāo).2.為了優(yōu)化現(xiàn)有的表達(dá)框架,使目的基因更有效地調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生物合成,應(yīng)用PCR技術(shù)從毛白楊(Populus tomentosa)基因組中分離得到木質(zhì)素合成相關(guān)酶—肉桂酸-4-羥化酶(C4H)基因啟動(dòng)子片段(GenBank注冊(cè)號(hào):AY351673).測(cè)序結(jié)果表明該啟動(dòng)子片段長1117bp,與雜交顫楊(P.kit