神經(jīng)元的發(fā)育與絲素蛋白材料結(jié)合的研究.pdf

1、神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機能單位，神經(jīng)的損傷或疾病引起的神經(jīng)元的變性、退化或喪失是不能或很難再生的。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)至今仍無有效的治療方法，因此尋找理想的治療方法是當前研究的重要課題。目前研究較多的是用神經(jīng)干細胞移植(NSCs)的方法來代替受損細胞，但是研究表明移植入的細胞到達損傷部位的為數(shù)很少，而對NSCs的分化機制也尚不清楚，且誘導(dǎo)NSCs定向分化的調(diào)控機制及技術(shù)亦未成熟，因此利用組織工程技術(shù)來誘導(dǎo)損傷修復(fù)細胞的遷移成為最近的

2、研究熱點。絲素蛋白由于其具有生物相容性好、易加工成各種形狀、可在生物體內(nèi)緩慢降解、來源豐富等優(yōu)點而倍受關(guān)注。目前對家蠶絲素蛋白的研究已有大量報導(dǎo)，而柞蠶絲素蛋白的研究還處于起步狀態(tài)，柞蠶絲素蛋白具有獨特的有利于細胞粘附的RGD三肽序列，因此柞蠶絲素蛋白極具開發(fā)潛力。 為探索神經(jīng)元與絲素蛋白材料結(jié)合的可行性及生物相容性，本研究首先建立了一個較純的神經(jīng)元培養(yǎng)體系，即從新生大鼠腦室下區(qū)(Subventricular Zone，SVZ)

3、分離細胞，分別以低密度培養(yǎng)在柞蠶、家蠶兩種絲素蛋白溶液制成的二維薄膜材料以及三維納米纖維材料上，在特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)三天后開始向神經(jīng)元分化。免疫熒光染色觀察神經(jīng)元的生長發(fā)育并檢測其成活率、復(fù)雜度。從成活率分析，神經(jīng)元在柞蠶絲素蛋白二維、三維材料上均比家蠶絲素蛋白材料高，而三維材料上神經(jīng)元的存活率又比二維材料高；從復(fù)雜度分析，神經(jīng)元在柞蠶絲素蛋白二維、三維材料上均比家蠶絲素蛋白材料高，而三維材料上神經(jīng)元的復(fù)雜度又比二維材料高。從而得出結(jié)論：

4、絲素蛋白材料支持神經(jīng)元的生長，具有良好的生物相容性；柞蠶絲素蛋白材料比家蠶絲素蛋白材料更適合神經(jīng)元的生長；三維納米纖維材料比二維薄膜材料更適合神經(jīng)元的生長。 體外分離純化培養(yǎng)的神經(jīng)元缺乏支持細胞以及各種細胞因子，且神經(jīng)元沒有分裂增殖能力，從而存活時間較短，在本實驗中第五天開始出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，因此接下來本研究進行了混合培養(yǎng)系統(tǒng)與絲素蛋白材料結(jié)合的研究，研究在有膠質(zhì)細胞支持作用下神經(jīng)元的生長發(fā)育。即從SD新生大鼠大腦皮層分離細胞，

5、接種在柞蠶、家蠶絲素蛋白來源的二維薄膜材料以及三維納米纖維材料上，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)六天，底層膠質(zhì)細胞已基本匯合，上層含有少量的神經(jīng)前體細胞，此時換成無血清培養(yǎng)基(DMEM serum free plus N2 Supplement)后，神經(jīng)前體細胞大量增殖，最終分化為神經(jīng)元。免疫熒光染色觀察以及BrdlJ摻入法檢測神經(jīng)前體細胞增殖，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與家蠶絲素蛋白相比，柞蠶絲素蛋白有助于細胞的粘附；與二維材料相比，三維

6、材料有助于細胞粘附；從BrdU摻入結(jié)果分析，柞蠶絲素蛋白上神經(jīng)前體細胞的增殖比例比家蠶絲素蛋白高，而三維材料與二維材料在神經(jīng)前體細胞的增殖方面未見明顯差別；然而從細胞形態(tài)的復(fù)雜程度來看，柞蠶、家蠶絲素蛋白材料均支持神經(jīng)元的分化，且三維納米纖維材料上神經(jīng)元具有較高的復(fù)雜度，能形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。成熟的神經(jīng)元是分裂后細胞，不具有DNA復(fù)制和細胞增殖功能，迄今為止，體外分離培養(yǎng)神經(jīng)元依然面I臨著許多困難，在一些細胞量需要大、觀察時間長的實驗研

7、究中，體外原代培養(yǎng)的神經(jīng)元很難滿足實驗的要求。因此，就需要尋找一種能夠反映神經(jīng)元特性，具有神經(jīng)元表型特征的體外替代細胞。PC12細胞是大鼠嗜鉻細胞瘤單克隆細胞株，從發(fā)育學(xué)角度看，嗜鉻細胞和交感神經(jīng)下細胞同源，體外培養(yǎng)時從形態(tài)到功能常表現(xiàn)出神經(jīng)元的本質(zhì)，一般作為神經(jīng)元模型。PC12細胞內(nèi)含有合成多種神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)鍵酶，因而具有分化為各種神經(jīng)元表型的潛能。實驗將PC12細胞與絲素蛋白材料相結(jié)合，并以全反式維甲酸(RA)為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)PC12細胞

8、向神經(jīng)元分化。通過免疫熒光染色觀察以及對PC12細胞誘導(dǎo)分化來的神經(jīng)元成活率、復(fù)雜度的檢測分析發(fā)現(xiàn)：絲素蛋白薄膜和絲素蛋白納米纖維對PC12細胞具有良好的生物相容性，能支持PCI2細胞的存活與生長；PC12細胞在絲素蛋白薄膜和絲素蛋白納米纖維上能被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元。并且證實了PC12細胞在絲素蛋白材料上誘導(dǎo)分化的過程中，絲素蛋白材料本身不影響RA對PC12細胞的誘導(dǎo)分化作用。 這些結(jié)果表明絲素蛋白材料可作為神經(jīng)類細胞生長的良好生