橘小實蠅成蟲腸道細菌分子多態(tài)性分析及其功能研究.pdf

1、橘小實蠅(Bactrocera dorsalis)是一種極具危害性的檢疫性害蟲,其食性廣、寄主雜,可危害柑桔、番石榴、楊桃、芒果和瓜類等40多個科250多種水果、蔬菜和花卉,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了很大的威脅。通過研究橘小實蠅成蟲腸道細菌多樣性,腸道可培養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)組成,及腸道細菌對寄主成蟲的引誘作用、存活率和壽命的影響,可為探討腸道菌群對寄主的生理功能和生態(tài)學(xué)意義奠定基礎(chǔ),為進一步了解寄主與其共生菌的協(xié)同進化、物種進化途徑提供新的認知,最終

2、為利用微生物防治此類害蟲提供新思路。
　　 本研究通過利用16s rRNA基因的PCR-DGGE分析技術(shù)研究了橘小實蠅三個種群(實驗室正常喂養(yǎng)種群,實驗室無菌糖水喂養(yǎng)種群和野生種群)成蟲腸道細菌多樣性及腸道可培養(yǎng)細菌的群落結(jié)構(gòu)組成；研究了腸道細菌對寄主成蟲的引誘作用；腸道細菌通過飼喂菌懸液的方式對寄主實蠅死亡率和壽命的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　 從橘小實蠅三個種群成蟲腸道分離到150種不同細菌遺傳型,分屬于γ-變形菌

3、綱(Gammaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteda)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidetes)、黃桿菌綱(Flavobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)等7個不同的細菌綱。在三個種群中,γ-變形菌綱都超過了腸道細菌總數(shù)的70％,是腸道的絕對優(yōu)勢細菌種類。此外,我們把每一種群所占比例

4、大于10％的類群也歸為優(yōu)勢細菌種類。因此,我們發(fā)現(xiàn)放線菌綱為實驗室種群的優(yōu)勢細菌種類(所占比例為10.1％),厚壁菌門為野生種群的優(yōu)勢細菌種類(所占比例為12.3％)。而δ-變形菌綱、擬桿菌綱和α-變形菌綱在三個種群中只占據(jù)很少的克隆子(每種類群都少于8個克隆子)。在三個種群的150個細菌遺傳型中,有3個分類組(文中標記為Unclassified)無法歸屬于目前已知的細菌類群,這是目前認識不足的一類微生物,可能與橘小實蠅腸道特殊的微環(huán)境

5、有關(guān)。以序列相似性大于97％的克隆歸為相同的細菌種類為標準,三個種群存在一些隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的共有菌種,如Klebsiella,Citrobacter,Enterobacter,Pectobacterium和Serratia。進一步對三個種群的多樣性指數(shù)計算及群落結(jié)構(gòu)組成分析表明,三個種群的細菌群落存在顯著性差異。其中實驗室無菌糖水喂養(yǎng)種群的細菌多樣性最低,只有很少的細菌遺傳型與另外兩個種群共存。而

6、實驗室種群和野生種群的細菌多樣性相對較高。
　　 從橘小實蠅三個種群成蟲腸道600株可培養(yǎng)細菌得到53種不同細菌遺傳型,分屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、腸球菌科(Entcrococcaceae)和芽孢桿菌科(Bacillaceae)等三個科。其中腸桿菌科是腸道可培養(yǎng)細菌最優(yōu)勢的細菌種類。同樣以序列相似性大于97％的菌株歸為相同的細菌種類為標準,找到了三個種群可培養(yǎng)細菌的共有菌種,結(jié)合菌落形態(tài)觀察和生理生化

7、特征鑒定,確定共有菌種為腸桿菌屬5株,克雷伯氏菌屬2株,檸檬酸桿菌屬1株,泛菌屬1株,腸球菌屬2株,以及芽孢桿菌屬4株。
　　 室內(nèi)引誘實驗發(fā)現(xiàn),所有供試菌株的不同處理發(fā)酵液對橘小實蠅均有顯著的引誘作用,其中以Bacillus cereus,Enterococcus faecalis,Enterobacter cloacae和Citrobacter freundii四種菌的引誘效果最好。菌懸液離心后的上清液高壓滅菌的引誘效果要好

8、于上清液的過濾除菌液和發(fā)酵原液。室內(nèi)引誘效果最好的六種菌進行了野外引誘實驗。結(jié)果表明:六種菌的引誘效果都好于對照,其中B.cereus和C freundii引誘到了最多的雌性、雄性和雌性加雄性實蠅,并且除Klebsiella oxytoca(引誘到的雌蠅和雄蠅一樣多)外其余五種菌引誘到的雌蠅都多于雄蠅,六種菌的野外引誘結(jié)果與室內(nèi)引誘結(jié)果一致。
　　 利用飼喂菌懸液的方法,研究了腸道可培養(yǎng)細菌占多數(shù)比例的腸桿菌科細菌和占少數(shù)比例的