橘小實(shí)蠅性別決定及分化分子機(jī)制研究.pdf

1、橘小實(shí)蠅(Bactrocera dorsalis)是一種危害250多種果實(shí)和蔬菜的重要農(nóng)業(yè)害蟲，給我國果蔬生產(chǎn)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。昆蟲具有多種多樣的性別決定機(jī)制，不僅不同昆蟲通過不同的基因和調(diào)控機(jī)制決定性別分化，甚至在同種昆蟲不同品系之間性別決定機(jī)制也不盡相同。昆蟲中決定性別的初始染色體信號差異較大，其中最典型的是Y染色體連接的雄性決定因子(M factor)決定雄性性別發(fā)育。但是，在包括橘小實(shí)蠅在內(nèi)的多種昆蟲中，假定的M因子還是未知的。

2、本研究以橘小實(shí)蠅為研究對象，利用RNA干擾(RNAi)、CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)和高通量測序技術(shù)等分子生物學(xué)手段，研究了橘小實(shí)蠅性別決定關(guān)鍵基因transformer的功能;鑒定出一種小分子microRNA作為雄性決定因子調(diào)控橘小實(shí)蠅早期胚胎性別分化;鑒定和研究了多種橘小實(shí)蠅性別偏向性microRNAs在兩性發(fā)育中的作用;驗證了保守性Let-7調(diào)控橘小實(shí)蠅發(fā)育過程。對橘小實(shí)蠅性別決定分子機(jī)制的研究，不僅為探索昆蟲性別分化通路上類似

3、基因的功能，以及確定新的性別決定基因提供參考，而且為昆蟲的遺傳操作提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。本研究為發(fā)展不依賴輻射處理的不育害蟲防治技術(shù)(SIT)提供了新的策略。
　　1.Transformer基因是昆蟲性別決定級聯(lián)系統(tǒng)中的一個雙開關(guān)基因，通過選擇性剪切來實(shí)現(xiàn)性別分化。為闡明性別決定關(guān)鍵基因在調(diào)控雌雄分化和雌蟲繁殖力中的功能，我們分離鑒定了橘小實(shí)蠅transformer和transformer-2，Bdtra經(jīng)過選擇性剪切轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩種雄

4、特異和一種雌特異的亞型，雌特異的亞型能翻譯成有功能的TRA蛋白，而雄特異的亞型由于終止密碼子不能翻譯成有功能的TRA蛋白。Bdtra上存在的TRA/TRA-2結(jié)合位點(diǎn)表明，TRA和TRA-2作為剪切調(diào)控因子通過Bdtra反饋調(diào)節(jié)來維持和促進(jìn)雌性的性別發(fā)育。早期胚胎發(fā)育過程中雌特異tra的表達(dá)模中tra-f在15小時達(dá)到高表達(dá)。通過RNA干擾對Bdtra進(jìn)行了功能研究，發(fā)現(xiàn)胚胎期敲除Bdtra基因能導(dǎo)致雌蟲雄性化，表明橘小實(shí)蠅在胚胎早期實(shí)

5、現(xiàn)性別分化;成蟲期敲除Bdtra基因能降低雌蟲卵黃蛋白基因yolkprotein gene(Bdyp1)的表達(dá)，進(jìn)而降低雌蟲產(chǎn)卵量，表明Bdtra基因能正向調(diào)控卵黃蛋白基因Bdyp1的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明利用性別決定關(guān)鍵基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因性別品系，通過釋放競爭力更強(qiáng)的不育雄蟲后代，能夠提高昆蟲不育技術(shù)對橘小實(shí)蠅的防治。
　　2.MicroRNAs(miRNAs)是一類小的內(nèi)源非編碼RNAs，能夠調(diào)控包括兩性異形在內(nèi)的多種生理過程。然而，

6、至今沒有對橘小實(shí)蠅雌雄成蟲和生殖腺中miRNAs進(jìn)行鑒定以及對miRNAs在性腺分化中的作用進(jìn)行闡述。我們通過對橘小實(shí)蠅性成熟雌蟲、雄蟲、卵巢和精巢構(gòu)建small RNA文庫，測序數(shù)據(jù)分析鑒定出183個已知和120個新miRNAs。對4個文庫中miRNAs表達(dá)量進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)18個雌性偏向表達(dá)和16個雄性偏向表達(dá)miRNAs，這些性別偏向性miRNAs可能參與性別分化。通過靶標(biāo)基因軟件預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)雌偏向性miR-989-3p靶向?qū)?/p>

7、蠅科昆蟲性別決定關(guān)鍵基因doublesex(dsx)，這表明miR-989-3p可能參與調(diào)控橘小實(shí)蠅性別分化。對雌成蟲飼喂miR-989-3p、miR-994-5p、miR-309-3p和miR-6-3p抑制劑促進(jìn)產(chǎn)卵量的增加，對雄成蟲飼喂miR-8-3p、miR-34-5p、miR-1-3p和miR-12-5p抑制劑使得雄蟲交配競爭力下降，對雌雄成蟲飼喂以上抑制劑都降低了成蟲存活壽命。這些結(jié)果表明性別偏向性miRNAs在維持雌雄生殖力

8、和壽命中起著重要作用。本研究首次揭示了橘小實(shí)蠅性別分化相關(guān)的miRNAs的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)miRNAs在性別間差異表達(dá)，這將促進(jìn)生殖器官特異表達(dá)miRNAs的功能研究。
　　3.在一些實(shí)蠅科昆蟲中，Y染色體連接的雄性決定因子(M factor)啟動性別決定途徑中的基本信號。然而，橘小實(shí)蠅中M因子及其性別決定分子機(jī)制還尚不明確。在本研究中，我們鑒定到橘小實(shí)蠅早期胚胎雄性性別發(fā)育關(guān)鍵時期是產(chǎn)卵后5、6和7小時，對5、6和7小時胚胎構(gòu)建s

9、mall RNA文庫，鑒定出65個胚胎差異表達(dá)miRNAs。在這些miRNAs中，有8個和Bdtra基因3’非編碼端(3'UTR)序列有堿基互補(bǔ)配對結(jié)合位點(diǎn)，其中結(jié)合自由能最低的是miR-1-3p。在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行的雙熒光素酶實(shí)驗表明miR-1-3p能抑制Bdtra的表達(dá)。胚胎注射miR-1-3p類似物和抑制劑分別下調(diào)62％和上調(diào)109％的Bdtra表達(dá)量，體外和體內(nèi)實(shí)驗表明Bdtra是miR-1-3p的靶標(biāo)基因。另外，胚胎注

10、射miR-1-3p類似物導(dǎo)致后代雄性化（92％的雄性后代表型），注射miR-1-3p抑制劑能導(dǎo)致后代雌性化（77％的雌性后代表型）。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除miR-1-3p導(dǎo)致突變雄性個體完全逆轉(zhuǎn)為雌性表型，且Bdtra和Bddsx基因進(jìn)行雌性特異剪切表達(dá)，這些結(jié)果表明miR-1-3p對橘小實(shí)蠅早期胚胎雄性性別決定是必需的，miR-1-3p作為雄性決定因子中間體，可能受到Y(jié)染色體連接的基本信號的激活，參與性別調(diào)控。
　　

11、4.MicroRNAs(miRNAs)調(diào)控昆蟲發(fā)育中多種生理過程，但是miRNAs在橘小實(shí)蠅幼蟲至蛹期發(fā)育中的作用還是未知的。在本研究中，利用在HEK293T細(xì)胞中的雙熒光素酶實(shí)驗，我們發(fā)現(xiàn)Bdo-Let-7作用于BdE75基因的3’非編碼端(3'UTR)，抑制BdE75基因的表達(dá)。Bdo-Let-7和BdE75在幼蟲至蛹期發(fā)育過程和不同組織中是共表達(dá)的。對三齡幼蟲注射Bdo-Let-7類似物和抑制劑分別下調(diào)62％和上調(diào)94％的BdE7