多功能生物可降解聚膦腈的制備及促成骨相關(guān)性能表征.pdf

1、聚膦腈是一種主鏈由交替的磷氮原子排列而成，側(cè)基為連接于磷原子上的兩個有機(jī)官能團(tuán)的有機(jī)-無機(jī)雜化高分子。聚膦腈材料的優(yōu)勢是可通過接枝不同的側(cè)基，使其具有廣泛可調(diào)節(jié)的親疏水性、生物相容性、生物可降解性、可加工成型性等，同時，由于其富含磷氮的分子結(jié)構(gòu)，具有顯著的成骨活性，是發(fā)展新一代骨再生修復(fù)材料的良好選擇。由于聚膦腈合成化學(xué)的限制，制約這類材料在組織工程研究中應(yīng)用的主要因素是力學(xué)性能和貯存穩(wěn)定性不足。利用聚膦腈的化學(xué)可修飾性強(qiáng)，發(fā)展具有光致

2、熒光、藥物控釋等多重功能性的聚膦腈骨再生修復(fù)材料，發(fā)展聚膦腈與其他生物材料的復(fù)合材料，以規(guī)避其不足，是該領(lǐng)域目前的研究趨勢。因此，本論文通過分子結(jié)構(gòu)設(shè)計，設(shè)計制備了數(shù)種聚膦腈材料體系，包括(1)可在體內(nèi)光致熒光顯影的生物可降解聚膦腈材料;(2)可在細(xì)胞內(nèi)光致熒光顯影并在原位釋放促成骨成分的聚膦腈高分子藥物納米粒材料;(3)可原位光交聯(lián)的聚膦腈/明膠復(fù)合水凝膠材料。最后，以氨基酸酯取代聚膦腈為研究對象，探索了聚膦腈材料促成骨分化的機(jī)制。<

3、br>　　生物可降解支架材料植入后在體內(nèi)的原位示蹤，以指示材料的體內(nèi)降解和去向，在組織工程研究中有著重要意義，但傳統(tǒng)生物可降解材料如脂肪族聚酯，往往缺乏反應(yīng)性官能團(tuán)，很難引入光致熒光發(fā)色團(tuán)。本論文利用聚二氯膦腈的高反應(yīng)性，通過將檸檬酸與巰基乙胺反應(yīng)得到的熒光小分子(TPCA)和丙氨酸乙酯共取代到聚膦腈主鏈，得到了熒光強(qiáng)度可控且熒光穩(wěn)定性高的生物可降解聚膦腈(PTA)。發(fā)現(xiàn)，PTA的熒光強(qiáng)度隨著TPCA側(cè)基比例的升高而上升，與TPCA小分

4、子相比，PTA的熒光穩(wěn)定性（濃度淬滅和光致漂白效應(yīng)）得到極大程度地提高;PTA的降解速率也隨著TPCA側(cè)基比例的升高而加快，但降解優(yōu)先從丙氨酸乙酯側(cè)基發(fā)生，未檢測到TPCA優(yōu)先從聚膦腈主鏈脫除，從而材料隨著降解一直保持較高的熒光強(qiáng)度。由此，PTA滿足體內(nèi)示蹤的應(yīng)用要求，大鼠皮下植入和顱骨缺損實驗結(jié)果均表明，可以實現(xiàn)機(jī)體內(nèi)無損實時監(jiān)控植入材料的降解和吸收。體內(nèi)外生物學(xué)表征結(jié)果顯示，PTA具有良好的生物相容性，體外能夠促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)

5、胞(rBMSCs)的成骨相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，體內(nèi)能顯著促進(jìn)骨缺損區(qū)域的再生。
　　相比于物理包埋藥物控釋體系易于出現(xiàn)爆發(fā)釋放，利用共價鍵結(jié)合負(fù)載藥物的高分子前藥，是通過聚合物的降解來實現(xiàn)控制釋放的，易于實現(xiàn)線性釋放。聚膦腈合成化學(xué)的靈活性，使以生物可降解聚膦腈為載體獲得高分子前藥具有可行性。將促成骨成分和氨基酸酯共同引入聚膦腈的側(cè)基，同時制備為易于被細(xì)胞內(nèi)吞的納米粒子，可實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的釋放和原位促成骨作用。因此，本論文以斯伐它汀為促成骨

6、成分，以具有光致熒光特性的色氨酸乙酯為共取代成分，制備了具有光致熒光特性的生物可降解高分子前藥(PTGP-SIM)，并采用共沉淀法制備了平均粒徑～150nm的納米粒子。rBMSCs對于PTGP-SIM納米粒子具有良好的內(nèi)吞性，并通過納米粒子的光致熒光特性證實其主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，隨著細(xì)胞的增殖和分化培養(yǎng)，它們一直留存在細(xì)胞內(nèi)部。由于聚膦腈屬于側(cè)鏈降解機(jī)理，斯伐它汀的釋放持續(xù)穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)沒有明顯的初期爆發(fā)釋放，因此，內(nèi)吞到細(xì)胞內(nèi)部納米粒

7、子持續(xù)釋放的斯伐它汀，表現(xiàn)出顯著地、持續(xù)地促成骨分化作用，是功能化聚膦腈材料作為促進(jìn)骨再生修復(fù)的新應(yīng)用形式。不過，PTGP-SIM納米粒子的濃度對rBMSCs的活性有影響，當(dāng)納米粒子濃度高于1g/L后，會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，在濃度為0.1g/L-0.4g/L之間會顯著抑制細(xì)胞的增殖，最終確定，PTGP-SIM納米粒子與rBMSCs的共培養(yǎng)濃度不宜高于0.04g/L。
　　可注射水凝膠由于創(chuàng)傷小、易于共混成型和加工、與細(xì)胞外基質(zhì)具有相似的

8、結(jié)構(gòu)而在組織修復(fù)研究中受到廣泛關(guān)注。利用聚膦腈易于功能化的特性，發(fā)展聚膦腈與天然高分子的復(fù)合水凝膠，可有效彌補(bǔ)單純聚膦腈材料力學(xué)性能不足，進(jìn)一步提高生物學(xué)性能。因此，本論文在聚膦腈主鏈上引入了帶有可光交聯(lián)雙鍵的香茅醇，并和低空間位阻、高親水性的二乙二醇單甲醚共取代制備了水溶性聚膦腈，同時合成了丙烯酸酯化明膠，通過溶液共混、光交聯(lián)的手段發(fā)展了可注射聚膦腈/明膠復(fù)合水凝膠，其力學(xué)性能和細(xì)胞行為均優(yōu)于單純的聚膦腈水凝膠。利用原位礦化法在水凝膠

9、中引入高生物活性的磷酸鈣無機(jī)粒子，可以進(jìn)一步提高水凝膠的機(jī)械性能和促成骨活性。需要指出的是，復(fù)合水凝膠中明膠的比例不宜超過10％，聚膦腈和明膠的相分離程度隨著明膠含量增加而提高，由此造成復(fù)合水凝膠的交聯(lián)密度和可注射性下降，降解和溶脹性質(zhì)也隨之發(fā)生改變，但仍能很好地滿足骨再生修復(fù)的需求。
　　最后，本論文對氨基酸酯取代聚膦腈促進(jìn)成骨分化的機(jī)制進(jìn)行了研究。普遍認(rèn)為，相對于其他生物可降解材料如聚酯，聚膦腈具有顯著的促成骨活性來源于其富磷

10、的化學(xué)結(jié)構(gòu)，然而，究竟是聚膦腈主鏈降解產(chǎn)生的磷酸根，還是細(xì)胞在富磷材料表面，對成骨分化的促進(jìn)作用更明顯，目前尚沒有清晰地認(rèn)識。因此，本論文合成了兩種降解速率不同的氨基酸酯取代聚膦腈(丙氨酸乙酯/甘氨酸乙酯共取代聚膦腈(PAGP)、苯丙氨酸乙酯/甘氨酸乙酯共取代聚膦腈(PPGP))，通過加速降解制備全降解產(chǎn)物，以不同濃度添加到培養(yǎng)基中，并以相同濃度的無機(jī)磷酸根培養(yǎng)基為對照，研究了降解產(chǎn)物中磷酸根和氨基酸酯對成骨分化的協(xié)同促進(jìn)作用。同時，通

11、過細(xì)胞與材料直接或間接接觸條件下的成骨分化研究，對照聚膦腈的降解速率，討論了氨基酸酯取代聚膦腈的表面元素組成對成骨分化的陰性。結(jié)果顯示，聚膦腈富磷的表面組成與細(xì)胞的直接接觸，以及聚膦腈降解產(chǎn)生的可溶性成分（磷酸根、氨基酸、胺根等），都能促進(jìn)rBMSCs的成骨分化，且活性表面的接觸促進(jìn)效果更加顯著。然而，接觸效應(yīng)對細(xì)胞行為的調(diào)控能力與材料自身的降解速率關(guān)系密切，降解較快的PAGP材料，隨著降解進(jìn)行，由于其表面性質(zhì)更新較快，接觸和非接觸狀態(tài)

12、對rBMSCs成骨分化的促進(jìn)作用并沒有檢測到顯著性差異?？梢哉J(rèn)為，具有合適降解速率的氨基酸酯取代聚膦腈材料，才能有效發(fā)揮其促成骨的生物活性。
　　綜上所述，化學(xué)結(jié)構(gòu)的可設(shè)計性和材料功能的多樣性，賦予了聚膦腈材料廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域和發(fā)展空間。在保證生物相容性和生物可降解性的前提下，引入適當(dāng)功能性側(cè)基的聚膦腈材料，不僅可具有本論文研究所發(fā)展的光致熒光、藥物控釋等特性，還可引入如抑菌性成分等更多功能，在骨組織工程方向有著令人期待的應(yīng)用前景。