利用表達(dá)代謝酶的細(xì)胞系測試間接致突變物作用特征.pdf

1、微核試驗(yàn)是常用的一種以染色體丟失和斷裂為遺傳學(xué)終點(diǎn)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法，其常用于研究外源化學(xué)物的細(xì)胞遺傳毒性，并結(jié)合著絲粒免疫熒光標(biāo)記技術(shù)分析外源化學(xué)物遺傳毒作用機(jī)制的類別。由于動物福利倫理的要求和動物試驗(yàn)的“3R”原則（優(yōu)化、減少、替代），體外微核試驗(yàn)逐漸成為化學(xué)物遺傳毒作用的一個(gè)重要的初篩試驗(yàn)方法。體外微核試驗(yàn)?zāi)壳俺Ｓ玫哪Ｐ褪侨祟惲馨图?xì)胞微核試驗(yàn)和哺乳動物細(xì)胞系微核試驗(yàn);前者優(yōu)點(diǎn)是靶細(xì)胞由人類來源，后者屬永生化細(xì)胞，增殖能力強(qiáng)、核型穩(wěn)定

2、、試驗(yàn)重現(xiàn)性佳。采用永生化哺乳動物細(xì)胞系的微核試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序包括如下暴露/恢復(fù)時(shí)程:受試細(xì)胞短時(shí)暴露(≤0.5個(gè)細(xì)胞周期)于受試化合物，繼以較長恢復(fù)時(shí)間（≥1.5個(gè)細(xì)胞周期）;若結(jié)果為陰性或可疑陽性，則進(jìn)行第二個(gè)程序的試驗(yàn);延長暴露時(shí)間（≥2個(gè)細(xì)胞周期）至細(xì)胞收獲（無恢復(fù)時(shí)間）。這樣包括兩個(gè)試驗(yàn)程序的方案可最大限度減少細(xì)胞遺傳毒物漏檢（假陰性）的幾率。已有報(bào)道，第一、第二個(gè)試驗(yàn)程序分別有利于檢測斷裂劑和致非整倍體劑。許多重要的環(huán)境致突變

3、物、致癌物須經(jīng)生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化后才能發(fā)揮其遺傳毒作用，所以體外微核試驗(yàn)中包括添加代謝活化系統(tǒng)以彌補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)測試細(xì)胞中生物轉(zhuǎn)化酶活性缺失的試驗(yàn)。經(jīng)典的外源性代謝活化體系是由酶誘導(dǎo)劑Aroclor1254處理的大鼠制備的肝微粒體與體外NADPH再生系統(tǒng)構(gòu)成的代謝活化體系（S9混合液），常用于化學(xué)物的體外遺傳毒性試驗(yàn)中。然而，S9混合液缺乏細(xì)胞色素P450(CYP)1B1和CYP2E1以及參與大量致癌物生物活化的多種非CYP酶系，對于一些需此類

4、酶系活化的間接致突變物的檢測并不適用;S9混合液也有酶活性不穩(wěn)定和致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化改變等缺點(diǎn)，所以，S9在體外微核試驗(yàn)中暴露時(shí)間受限。為克服S9混合液的不足，在遺傳毒性機(jī)制研究中可使用表達(dá)人類生物轉(zhuǎn)化酶的細(xì)胞系來代替細(xì)胞外代謝活化系統(tǒng)。
　　為了印證文獻(xiàn)報(bào)道的斷裂劑和致非整倍體劑對染毒時(shí)程的不同選擇性。本課題先是采用已知的染色體斷裂劑（絲裂霉素C和博來霉素）和致非整倍體劑（秋水仙堿和長春花堿）對中國地鼠肺成纖維(V79)細(xì)胞染毒，

5、染毒方案分別采取以下不同暴露/恢復(fù)時(shí)程:0h/24h（陰性對照）、3h/21h、6h/18h、12h/12h、18h/6h和24h/0h，然后檢測各組微核細(xì)胞率。然而，重組表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶的受試細(xì)胞對間接致突變物的代謝活化是一個(gè)可能出現(xiàn)酶蛋白飽和現(xiàn)象及需要時(shí)間的過程，其是否影響暴露/恢復(fù)時(shí)程與所測試受試物微核形成機(jī)制的特定關(guān)系則尚無報(bào)道。使用共表達(dá)人CYP2E1酶和人硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)1A1酶的重組中國地鼠肺成纖維(V79)細(xì)胞(V

6、79-hCYP2E1-hSULT1A1)來初步探討數(shù)種需生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化的外源化學(xué)物的遺傳毒作用機(jī)制。其中，1-甲基芘經(jīng)CYP2E1酶和SULT1A1酶先后兩步生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)而活化，1-羥甲基芘經(jīng)SULT1A1酶活化形成致突變物（二者未經(jīng)代謝活化均無遺傳毒性）;氫醌、兒茶酚和1，2，4-三羥基苯則被CYP2E1酶活化成活性增強(qiáng)的致突變物。微核試驗(yàn)方法同以上第一部分，探討暴露/恢復(fù)時(shí)程對這些受試物誘發(fā)微核作用的影響，此外還分析各受試物誘導(dǎo)

7、細(xì)胞有絲分裂阻滯的作用（作為微管毒性的標(biāo)志），為判斷受試物可能的遺傳毒作用機(jī)制（斷裂劑或致非整倍體劑）提供線索。本課題選取前期研究中以不同（遞減）強(qiáng)度誘發(fā)V79-hCYP2E1-hS ULT1A1細(xì)胞微核形成的4種PCB化合物（PCB20、PCB18、PCB5和PCB28），N-亞硝基二甲基胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA，依賴于CYP2E1活化的強(qiáng)致突變物）作為參考性已知間接致突變物探討這5種化學(xué)物誘發(fā)表達(dá)小

8、鼠CYP2E1酶的V79重組細(xì)胞(V79-mCYP2E1)和V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞Hprt基因座突變作用，比較兩個(gè)種屬CYP2E1酶代謝活化作用的選擇性和活化強(qiáng)度的差異，以期為相關(guān)動物試驗(yàn)的物種選擇提供依據(jù)。
　　目的：
　　1.印證不同外源化學(xué)物誘發(fā)哺乳動物細(xì)胞微核形成所需敏感的暴露/恢復(fù)時(shí)程與微核形成機(jī)制（斷裂作用與致非整倍體作用）之間的關(guān)系。
　　2.研究需經(jīng)生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化的幾個(gè)外源化學(xué)

9、物在不同暴露/恢復(fù)時(shí)程條件下誘導(dǎo)重組表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶的哺乳動物細(xì)胞系微核的作用，從而明確代謝環(huán)節(jié)是否構(gòu)成對微核形成的時(shí)程毒理學(xué)的影響，以及相關(guān)間接遺傳毒物作用的可能機(jī)制。
　　3.探討人和小鼠兩個(gè)種屬的CYP2E1酶分別對NDMA和4種PCBs誘發(fā)基因突變的作用，以闡明這兩個(gè)種屬的CYP2E1對PCBs代謝活化作用的相似度或差異性。
　　方法：
　　1.細(xì)胞增殖/存活測定（CCK-8試驗(yàn)）
　　2.微核試驗(yàn)

10、　　3.有絲分裂細(xì)胞率的分析
　　4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western Blot)
　　5.Hprt基因座致突變試驗(yàn)
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　結(jié)果：
　　1.斷裂劑絲裂霉素C(MMC)和博萊霉素(BLM)誘發(fā)V79細(xì)胞微核的作用隨暴露/恢復(fù)時(shí)程變化呈現(xiàn)雙相反應(yīng):首先隨著暴露時(shí)間延長微核細(xì)胞率逐漸增高，于12h/12h達(dá)到峰值，然后逐漸下降。而致非整倍體劑秋水仙素(CO

11、L)和長春花堿(VBL)誘發(fā)微核的作用則一直隨暴露時(shí)間延長而增高，于24h/0h達(dá)最高值。此外COL和VBL可誘發(fā)V79細(xì)胞有絲分裂阻滯，而MMC和BLM無此作用;與之對應(yīng)的是前二者對細(xì)胞存活/生長具有一定抑制作用，而后二者沒有明顯影響。以上結(jié)果對后續(xù)利用表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶細(xì)胞微核試驗(yàn)染毒過程的探索提供了適當(dāng)參考。
　　2.與COL和VBL對V79細(xì)胞的作用類似，1-甲基芘(1-MP)和1-羥甲基芘(1-HMP)對V79-hCYP2E

12、1-hSULT1A1細(xì)胞誘發(fā)微核的作用在暴露/恢復(fù)時(shí)程為18h/6h時(shí)達(dá)到峰值;苯的羥化代謝物對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞的作用則與斷裂劑對V79細(xì)胞的作用相似:兒茶酚(CAT)和1，2，4-三羥基苯(THB)在6h/18h時(shí)誘發(fā)微核作用最強(qiáng)，氫醌(HQ)作用的峰值出現(xiàn)在暴露時(shí)間稍長的時(shí)程。此外，1-MP和1-HMP對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞呈現(xiàn)一定細(xì)胞毒作用，且隨暴露時(shí)間延長而增強(qiáng);相反，HQ、C

13、AT和THB則沒有明顯的細(xì)胞毒作用。并且，1-HMP和1-MP誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞明顯的有絲分裂阻滯，而CAT、THB和HQ則無明顯作用。在各暴露/恢復(fù)時(shí)程條件下，各受試物的高劑量組誘發(fā)微核和有絲分裂阻滯的作用均強(qiáng)于低劑量組。
　　3.蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，V79-mCYP2E1相比于V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞中CYP2E1蛋白表達(dá)水平略低。五個(gè)受試化合物對V79細(xì)胞均未誘發(fā)基因突變;

14、然而，NDMA對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞和V79-mCYP2E1細(xì)胞均強(qiáng)烈誘發(fā)基因突變，且呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，PCB5和PCB18可明顯誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞基因突變，但對V79-mCYP2E1細(xì)胞僅有微弱的致突變作用。PCB20和PCB28對后兩種受試細(xì)胞僅有微弱的致突變作用。
　　結(jié)論：
　　1.與既往報(bào)道相似，不同暴露/恢復(fù)時(shí)程下，斷裂劑和致非整倍體劑誘發(fā)V79細(xì)胞微核

15、的作用有明顯差異，分別于不同時(shí)程（12h/12h和24h/0h）達(dá)到其作用的峰值。結(jié)果提示在采用細(xì)胞系的體外微核試驗(yàn)中，短暴露/長恢復(fù)時(shí)程可能有利于檢測斷裂劑的作用，而長暴露/短（或零）恢復(fù)則更易檢出致非整倍體劑。
　　2.根據(jù)以上斷裂劑和致非整倍體劑誘發(fā)培養(yǎng)細(xì)胞微核作用與暴露/恢復(fù)時(shí)程的關(guān)系，結(jié)合不同受試物對V79-hCYP2E1-hSULT1A1誘發(fā)微核及有絲分裂阻滯作用的差異，可認(rèn)為兩個(gè)烷基化芘化合物（1-HMP和1-MP）

16、經(jīng)CYP2E1酶和/或SULT1A1酶代謝活化成為具有微管毒性及致非整倍體毒性的代謝物;而苯的羥化代謝物中，CAT和THB具有斷裂作用，HQ則可能兼有斷裂作用與致非整倍體作用。代謝活化雖有時(shí)間依賴性，但上述間接致突變物誘發(fā)微核作用的時(shí)程與直接致突變物相比并不延遲，所以細(xì)胞系微核試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序至少對本研究采用的細(xì)胞內(nèi)代謝活化模型是適用的。
　　3.受試化合物對表達(dá)不同種屬CYP2E1的V79重組細(xì)胞致突變作用在強(qiáng)度和效能上的差異，特