2型糖尿病大鼠腎臟Toll樣受體4和A20表達及辛伐他汀干預的實驗研究.pdf

1、目的：隨著生活水平的提高和生活方式的改變，糖尿病(diabetesmellitus，DM)的患病率在全球范圍內呈逐年上升趨勢。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，也是導致終末期腎功能衰竭的重要原因。Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)是Toll蛋白家族的重要成員之一，也是人類發(fā)現(xiàn)的第一個Toll相關蛋白，參與了機體的多種炎癥和免疫反應。研究表明，TL

2、R4與糖尿病本身及糖尿病慢性并發(fā)癥有一定關系，但對于TLR4與DN關系的直接研究相對較少。鋅指蛋白A20是一種Cys2/Cys2型胞液鋅指蛋白，在炎癥反應中，幾乎體內所有器官和組織細胞都能表達，它的主要作用是限制炎癥反應中核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)活性，保護組織細胞免受損傷，是一種內源性調控蛋白。他汀類藥物是臨床上應用較多的調脂類藥物且療

3、效確切，近來有研究表明辛伐他汀有減輕炎癥反應的作用，其作用獨立于降脂作用外。本實驗通過高糖高脂飲食喂養(yǎng)Sprague-Dawlay(SD)大鼠，使大鼠產生高胰島素血癥和胰島素抵抗，后注射小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)破壞大鼠胰島β細胞，從而復制2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠模型。應用免疫組化法和RT-PCR法檢測大鼠腎臟中TLR4和A20的表達情況，揭示TLR4和A2

4、0與DN的關系；并給予部分糖尿病大鼠進行辛伐他汀干預治療，以探討其對糖尿病大鼠腎臟的防治作用及其可能的作用機制。
　　方法：應用隨機數(shù)字表從40只SD大鼠中隨機選取10只作為正常對照組(A組)，喂以普通飼料，其余作為實驗組，給予高糖高脂飼料(普通飼料中加入15％熟豬油、2.5％膽固醇、20％蔗糖)，實驗組大鼠體重逐漸增加，產生胰島素抵抗，4周后腹腔注射小劑量STZ，劑量為30mg/kg，6周后測空腹血糖(fasting blood

5、 glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(fastinginsulin，F(xiàn)INS)水平，選取FBG>7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感指數(shù)(insulinsensitivity，ISI)降低者為2型糖尿病模型。將造模成功的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組(B組，13只)和辛伐他汀干預組(C組，13只)，實驗共14周。于第14周末測量各組大鼠體重，心臟取血測定FBG、膽固醇(cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，T

6、G)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)、血肌酐(serum creatinine，Cr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、留24h尿測定尿白蛋白(urinary albumin，UAlb)水平；取大鼠腎臟，稱重并計算腎臟肥大指數(shù)(KW/

7、BW)；取腎臟組織多聚甲醛固定待光鏡下觀察；應用免疫組化法檢測腎臟TLR4和A20蛋白的表達，使用計算機圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，計算TLR4和A20的IHS；用RT-PCR法檢測腎臟TLR4 mRNA，用Bandscan5.0凝膠分析系統(tǒng)測定OD值。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對結果進行統(tǒng)計學處理，兩組比較采用t/t’檢驗，組間比較時，采用方差分析或秩和檢驗。
　　結果：
　　1.實驗第6周末各指標結果：注射STZ兩周后，

8、實驗組大鼠FBG為12.02±1.83 mmol/L，高于正常對照組的6.16±0.38 mmol/L(P<0.01)；實驗組的FINS為18.37(18.08，19.43)mIU/L，與對照組的17.75(17.08，18.53)mIU/L比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但糖尿病組的ISI為0.0046(0.0038，0.0052)低于正常對照組的0.0094(0.0088，0.0095)(P<0.01)，此時2型糖尿病大鼠模型復制

9、成功。
　　2.實驗14周末檢測指標A組大鼠FBG5.72±0.43 mmol/L、TG0.78±0.45mmol/L、TC2.40±0.21 mmol/L、LDL-C1.23±0.16mmol/L、HDL-C1.29±0.25 mmol/L、UAlb2.67±0.21ug/24h、Cr59.02±3.02μmmol/L、BUN5.22±0.31 mmol/L、Ccr0.79±0.36 ml/min、RW/BW1.60±0.10；

10、
　　B組大鼠FBG12.37±3.0 mmol/L、TG1.81±0.24 mmol/L、TC5.50±0.82mmol/L、LDL-C2.12±0.11 mmol/L、HDL-C0.53±0.15 mmol/L、UAlb26.31±0.62 ug/24 h、Cr96.20±10.01μmol/L、BUN9.54±0.72 mmol/L、Ccr0.19±0.28 ml/min RW/BW1.90±0.22；
　　C組FBG

11、11.5±2.0 mmol/L、TG1.06±0.31 mmol/L、TC2.93±0.42 mmol/L、LDL-C1.63±0.04 mmol/L、HDL-C1.03±0.11 mmol/L、UAlb16.61±1.02ug/24 h、Cr71.21±5.01μmol/L、BUN6.11±0.72 mmol/L、Ccr0.79±0.35ml/min、RW/BW1.60±0.22；
　　B組大鼠的FBG、TG、TC、LDL-C、

12、UAlb、BUN、Cr、RW/BW水平均高于A組(P<0.05)，HDL-C和Ccr低于A組P<0.01)；C組大鼠的FBG、TG、TC、LDL-C、UAlb、BUN、Cr、RW/BW水平均低于B組，而HDL-C、Ccr水平高于B組(P<0.05)。
　　3.腎臟HE染色：A組腎小球形態(tài)規(guī)整，腎小球內細胞排列規(guī)則，腎小球毛細血管網基底膜清晰規(guī)整；B組腎小球體積明顯增大，腎小球內細胞明顯增多；C組腎小球體積有所減小，腎小球內細胞有所

13、減少，但與A組仍有差別。
　　4.腎臟TLR4和A20蛋白表達：免疫組化圖像分析顯示，B組大鼠腎臟TLR4蛋白表達的IHS值為7.8±1.3，明顯高于A組的2.0±1.0(P<0.01)，C組大鼠TLR4蛋白表達的IHS值為4.2±1.3，低于B組(P<0.01)；B組大鼠腎臟A20蛋白表達的mS值為4.8±.0.8，高于A組的2.0±1.0(P<0.05)，C組大鼠A20蛋白表達的IHS值為2.8±0.4，低于B組(P<0.05

14、)。
　　5.腎臟TLR4 mRNA的表達：Bandscan5.0凝膠分析系統(tǒng)顯示，B組大鼠腎臟TLR4 mRNA/β-action mRNA為0.82±0.05，高于A組的0.378±0.025(P<0.01)，C組大鼠TLR4 mRNA/β-action mRNA為0.616±0.043，低于B組(P<0.01)。
　　6.相關性分析TLR4與24小時尿蛋白、血肌酐、A20呈正相關，相關系數(shù)分別為0.679、0.586、

15、0.576(P均小于0.05)。
　　結論：
　　1.T2DM大鼠尿白蛋白、尿素氮、血肌酐、KW/BW水平均高于正常、Ccr低于正常，HE染色顯示腎小球體積明顯增大，腎小球內細胞明顯增多，說明2型糖尿病大鼠已存在糖尿病腎臟病變。
　　2.T2DM大鼠腎臟TLR4表達增多，提示TLR4參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展；作為NF-κB的負調控蛋白的A20表達增加，提示其對炎癥反應有一定的抑制，從而對機體產生保護作用。對TLR4和