堿基錯(cuò)配對(duì)核酸穩(wěn)定性及其解鏈溫度（Tm）的影響.pdf

1、目的：基因芯片技術(shù)是二十世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域重大的發(fā)明之一。它的應(yīng)用前景非常廣泛，然而，基因芯片的實(shí)際應(yīng)用還有很多的限制，最主要的原因是目前它的檢測(cè)準(zhǔn)確度還沒(méi)有達(dá)到準(zhǔn)確無(wú)誤的程度，經(jīng)常出現(xiàn)假性信號(hào)，誤導(dǎo)檢測(cè)結(jié)果。基因芯片檢測(cè)是基于核酸的互補(bǔ)雜交原理，由于檢測(cè)目的的不同，芯片表面探針的長(zhǎng)短和堿基序列各不相同，其與互補(bǔ)鏈的解鏈溫度也高低不一。為了確保芯片表面的所有探針在同一檢測(cè)溫度下，都能準(zhǔn)確無(wú)誤地識(shí)別出各自的靶標(biāo)序列，探針的解鏈溫度應(yīng)盡量設(shè)計(jì)

2、的一致，同時(shí)還應(yīng)盡量增大探針與靶標(biāo)序列和與非靶標(biāo)核酸結(jié)合的解鏈溫度的差異。 有人嘗試將具有更高結(jié)合能的DNA衍生物加入到探針序列中，從而達(dá)到人工調(diào)控基因探針解鏈溫度的目的。 但目前人們對(duì)這類DNA衍生物的研究還不充分，對(duì)于它們不同的堿基類型，不同的取代位點(diǎn)，不同的組合方式，是如何影響互補(bǔ)雙鏈的解鏈溫度的，還沒(méi)有進(jìn)行全面，深入地研究。 這里設(shè)計(jì)了一套實(shí)驗(yàn)來(lái)研究錯(cuò)配的類型，錯(cuò)配的數(shù)量，錯(cuò)配的位點(diǎn)對(duì)互補(bǔ)雜交雙鏈熱力學(xué)特

3、性的影響。同時(shí)，還研究了其它一些在芯片檢測(cè)中可能遇到的情況，如堿基缺失和插入，非等長(zhǎng)鏈的雜交，含有靶標(biāo)核酸與非靶標(biāo)核酸混合溶液的檢測(cè)等等。 一、寡核酸序列材料與方法本文所用寡核酸樣品從寶生物工程(大連)有限公司和聯(lián)星生物工程有限公司訂制，所有的核酸樣品用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液(NaCl溶度為0.1M)，稀釋至50μM，保存在-20℃冰箱中。 二、雜交及解鏈溫度的測(cè)定各取4μL的靶標(biāo)和探針寡核酸溶液在室溫進(jìn)行

4、雜交，并用緩沖液稀釋至200ml，使靶標(biāo)和探針的溶度都為1μM。 本實(shí)驗(yàn)用瓦里安公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)(Cary 100)，在260nm下測(cè)量雜交雙鏈的吸收值，得到解鏈溫度。 三、溫度梯度PCR我們分別在上游引物的不同位置用與模板DNA錯(cuò)配的堿基來(lái)進(jìn)行替代，并在引物最佳退火溫度附近設(shè)計(jì)了5個(gè)溫度梯度，來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。 結(jié)果與討論: 1，不同的堿基錯(cuò)配類型其穩(wěn)定性也各不相同。堿基對(duì)的穩(wěn)定性順序如下：

5、GT=GA)AA=TT>TC≥AC≥CC。 2，錯(cuò)配發(fā)生的位置對(duì)核酸的穩(wěn)定性也有影響，當(dāng)錯(cuò)配堿基位于端點(diǎn)時(shí)，其穩(wěn)定性高于在中間位置的錯(cuò)配。 3，堿基的插入與缺失降低了雜交雙鏈的穩(wěn)定性，堿基的插入和缺失在雙鏈中形成“泡”形結(jié)構(gòu)，含有一個(gè)“泡”的雙鏈比含有一個(gè)錯(cuò)配的雙鏈更穩(wěn)定。 4，雜交雙鏈形成“尾巴”結(jié)構(gòu)時(shí)，雜交雙鏈親和力與“尾”部末段的堿基配對(duì)類型有關(guān)，GC穩(wěn)定性高，它出現(xiàn)在“尾”部末段時(shí)，降低了“尾巴”擺動(dòng)對(duì)雜