通過(guò)化學(xué)修飾優(yōu)化核酸的穩(wěn)定性及其對(duì)核酸生物活性影響的研究.pdf

1、RNA干擾(RNAi)是一種高效的序列特異性的基因沉默現(xiàn)象。1998年，F(xiàn)ire和Mello提出RNA干擾的理論，并因此獲得了2006年諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。2001年，Tuschl等研究發(fā)現(xiàn)除長(zhǎng)片段雙鏈RNA外，小干擾RNA(siRNA)同樣具有誘導(dǎo)基因沉默的功效，特別是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。雖然siRNA的強(qiáng)大的基因沉默功能使其在疾病治療領(lǐng)域擁有廣闊的前景，但其自身雙鏈RNA的性質(zhì)并不適合作為藥物分子。綜合分析siRNA作為藥物的不足之處

2、，作者認(rèn)為首要解決的問(wèn)題是穩(wěn)定性的提高，包括熱力學(xué)穩(wěn)定性和血清中穩(wěn)定性。其理念是穩(wěn)定性的提高有助于降低siRNA在治療中的藥物使用量，從而起到緩解免疫刺激反應(yīng)和脫靶效應(yīng)的作用。此外，藥物使用量的減小可以使導(dǎo)入活性的優(yōu)化更為簡(jiǎn)便。
　　為實(shí)現(xiàn)siRNA穩(wěn)定性的提高，作者設(shè)計(jì)通過(guò)化學(xué)修飾在siRNA雙鏈的3'和5'位末端分別引入不同的反應(yīng)基團(tuán)，再由不同反應(yīng)基團(tuán)間的共價(jià)鍵交聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建雙端封閉的啞鈴型RNA。啞鈴型RNA不僅可有效抑制RN

3、A雙鏈的解旋，其非天然結(jié)構(gòu)的修飾末端還能阻止核酸外切酶的水解作用，最終達(dá)到提高siRNA穩(wěn)定性的目的?？紤]到懸突結(jié)構(gòu)在核酶Dicer的切割過(guò)程中起定位作用，作者在實(shí)驗(yàn)實(shí)施中還構(gòu)建了單端封閉的發(fā)卡型RNA。
　　在設(shè)計(jì)之初，作者選擇Cu(I)催化的疊氮化物和炔的Huisgen1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)構(gòu)建核酸交聯(lián)。但是，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，作者發(fā)現(xiàn)該方法會(huì)造成RNA的嚴(yán)重降解。經(jīng)總結(jié)，Cu離子的氧化還原反應(yīng)造成了RNA的損傷。盡管有報(bào)道稱

4、引入Cu配體可緩解損傷，例如TBTA、THPTA等，但是由于損傷后的siRNA在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)是未知的，伴隨siRNA的高沉默活性所造成的后果是難以預(yù)測(cè)的。因此，尋找非金屬催化的快速定量，條件溫和，且生物兼容性好的“點(diǎn)擊”化學(xué)反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)RNA的交聯(lián)修飾，成為作者新的研究方向。
　　在尋找新型非金屬催化交聯(lián)反應(yīng)的過(guò)程中作者注意到了同實(shí)驗(yàn)室易龍的工作——基于巰基邁克爾加成反應(yīng)的新型熒光探針。該新型熒光探針具有快速定量，條件溫和，選擇

5、性好等優(yōu)點(diǎn)，并已證明可成功應(yīng)用于RNA修飾。在探針工作的基礎(chǔ)上，作者設(shè)計(jì)合成了連接分子——對(duì)苯二馬來(lái)酰胺酸甲酯，希望通過(guò)其雙端與巰基的邁克爾加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)核酸的末端交聯(lián)。巰基的邁克爾加成反應(yīng)是一個(gè)理想的選擇，其原因有:(1)巰基修飾可通過(guò)固相合成儀引入核酸，還可通過(guò)半胱氨酸突變引入蛋白質(zhì);(2)反應(yīng)快速定量，反應(yīng)條件溫和，可在水相中進(jìn)行;(3)生成的共價(jià)鍵連接產(chǎn)物穩(wěn)定性好，生物兼容性好。
　　在DNA交聯(lián)部分工作中，作者應(yīng)用巰基與

6、馬來(lái)酰胺酸甲酯間的邁克爾加成反應(yīng)，成功實(shí)現(xiàn)了DNA的單雙末端交聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)建出了發(fā)卡型DNA(hpODN)和啞鈴型DNA(dbODN)。該新型非金屬催化交聯(lián)體系具有反應(yīng)快速，選擇性高，不會(huì)造成DNA損傷等優(yōu)點(diǎn)。所得交聯(lián)產(chǎn)物在不影響B(tài)型雙螺旋結(jié)構(gòu)的前提下，熱力學(xué)穩(wěn)定性得到顯著的改善，并可被限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。
　　在RNA交聯(lián)部分工作中，作者應(yīng)用巰基與馬來(lái)酰亞胺間的邁克爾加成反應(yīng)，成功實(shí)現(xiàn)了RNA的單雙末端交聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)建出了發(fā)卡型R

7、NA(hpRNA)和啞鈴型RNA(dbRNA)。該新型非金屬催化交聯(lián)體系具有反應(yīng)快速，選擇性高，產(chǎn)物穩(wěn)定，且不會(huì)造成RNA損傷等優(yōu)點(diǎn)。所得交聯(lián)產(chǎn)物在不影響A型雙螺旋結(jié)構(gòu)的前提下，熱力學(xué)穩(wěn)定性和血清中穩(wěn)定性得到顯著的改善。修飾RNA可以被核酶Dicer識(shí)別切割，其RNA干擾活性與天然siRNA在同一水平，且具有更長(zhǎng)的干擾活性時(shí)間。
　　siRNA穩(wěn)定性的提高是RNA干擾領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題。作者首次將巰基邁克爾加成反應(yīng)應(yīng)用于RNA的交