基于化學(xué)修飾電極對(duì)核酸檢測(cè)的研究.pdf

1、核酸是活細(xì)胞中最為關(guān)鍵的組分，它包含了遺傳信息，并參與這些信息的表達(dá)，調(diào)理著細(xì)胞的代謝過程。脫氧核糖核酸(DNA)作為生物體的基本遺傳物質(zhì)，是生命化學(xué)的中心，也是研究生命現(xiàn)象的關(guān)鍵。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)修飾方法中的一種，對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起著重要作用，不斷得到研究者的重視。而microRNA(miRNA)則參與調(diào)控生物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、形態(tài)變化及細(xì)胞凋亡等機(jī)體一系列重要的生理過程，其表達(dá)的研究至關(guān)重要。電化學(xué)DNA生物傳感器由于

2、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、無污染、操作方便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、生物工程、食品檢測(cè)、環(huán)境研究等領(lǐng)域。電化學(xué)DNA生物傳感器的提出，被認(rèn)為溝通了電化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)科聯(lián)系。本研究基于新型納米材料構(gòu)建了三種電化學(xué)DNA生物傳感器，分別對(duì)DNA片段、DNA甲基化和microRNA-21的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，主要工作如下:
　　 (1)本實(shí)驗(yàn)制備了一種基于納米金(AuNPs)鎖核酸標(biāo)記的發(fā)卡DNA探針(LNA-m-HpDNA)和酶信號(hào)放大技

3、術(shù)的DNA生物傳感器。采用循環(huán)伏安法(CV)和電化學(xué)交流阻抗法(EIS)對(duì)修飾電極進(jìn)行了表征。由于加入了親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)，親和素和生物素會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合，從而將HRP固定于電極表面。HRP在H2O2存在時(shí)對(duì)對(duì)苯二酚(HQ)產(chǎn)生催化反應(yīng)，通過產(chǎn)物苯醌(HQ2)的還原信號(hào)間接檢測(cè)DNA的雜交反應(yīng)。結(jié)果表明，該傳感器通過計(jì)時(shí)電流法(CA)對(duì)DNA實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)，同時(shí)可以很好的區(qū)分單堿基錯(cuò)配、三堿基

4、錯(cuò)配、完全非互補(bǔ)DNA序列與完全互補(bǔ)序列，具有良好的特異選擇性。檢測(cè)范圍為10-1000 pmol/L，檢出限為6.0 pmol/L。
　　 (2)基于活化后的表面活性功能化石墨烯(SDS-GR)修飾的高純石墨電極(PGE)，制備了一種可對(duì)5-甲基胞嘧啶(5-mC)進(jìn)行直接電化學(xué)檢測(cè)的生物傳感器。SDS-GR能夠增大電極有效表面積，增強(qiáng)導(dǎo)電性。修飾電極的活化過程使電極表面覆蓋帶有負(fù)電荷的含氧基團(tuán)，可大量吸附帶有正電荷的堿基。該電

5、極具有寬的氧化電位窗口，在同時(shí)存在鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的條件下，可在低電位成功檢測(cè)5-mC的含量。由堿基互補(bǔ)配對(duì)原則得知雙鏈DNA(dsDNA)中，T和A的含量相等。為避免胸腺嘧啶(T)對(duì)5-mC的干擾，繪制單獨(dú)A和5-mC的線性關(guān)系曲線。檢出范圍分別為1-100μmol/L，2.5-100μmol/L。該傳感器為5-mC的直接電化學(xué)檢測(cè)提供了新的發(fā)展平臺(tái)。
　　 (3)本實(shí)驗(yàn)基于生物條形碼(DNA-Au)和

6、hemin/G-四聯(lián)體DNA模擬酶制備了一種可靈敏檢測(cè)microRNA-21(miRNA-21)的電化學(xué)生物傳感器。DNA-Au極大的增加了miRNA-21的雜交量，hemin/G-四聯(lián)體DNA模擬酶對(duì)HQ的氧化起催化作用。通過上述兩步，擴(kuò)大檢測(cè)信號(hào)。采用循環(huán)伏安法(CV)和電化學(xué)交流阻抗法(EIS)對(duì)修飾電極進(jìn)行了表征。在最佳條件下，使用示差脈沖伏安技術(shù)(DPV)實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-21定量檢測(cè)。檢測(cè)范圍為0.01-500 pmol/