負載轉(zhuǎn)化生長因子-β1的殼聚糖緩釋微球復合納米骨修復兔橈骨缺損的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　在實驗室中自行制備轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/殼聚糖緩釋微球、納米羥基磷灰石/膠原支架材料及負載轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/殼聚糖緩釋微球的納米羥基磷灰石/膠原支架材料。然后分別以單純支架材料及負載轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/殼聚糖緩釋微球的支架材料應用于兔橈骨骨缺損的修復。通過觀察術后各個固定時間段骨缺損區(qū)成骨修復情況，來證實納米羥基磷灰石/膠原骨修復兔橈骨骨缺損的能力及轉(zhuǎn)化生長因子-β1

2、在骨組織修復過程中的效應。為應用骨組織工程方式臨床修復大塊骨缺損探尋一種有效的方法。
　　研究方法：
　　1.應用乳化交聯(lián)法制備負載TGF-β1的殼聚糖緩釋微球，并對TGF-β1殼聚糖緩釋微球的外觀形態(tài)、載藥量、包封效率及體外釋放情況進行分析。
　　2.制備納米羥基磷灰石/膠原骨及納米人工骨/TGF-β1殼聚糖緩釋微球復合人工骨，并對兩種人工骨進行掃描電鏡觀察、孔隙率、力學性能進行測定。
　　3.選擇普通新西蘭大

3、白兔45只，雙側橈骨手術建立10mm骨缺損模型，同時將單純納米羥基磷灰石/膠原骨支架材料植入左側橈骨骨缺損中，設定為對照組；將負載轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/殼聚糖緩釋微球的納米羥基磷灰石/膠原支架材料植入右側橈骨骨缺損中，設定為實驗組。在手術后的第2周、第4周、第6周、第8周、第12周時間段，每次隨機從45只實驗動物中選取9只處死，對其雙前肢行X射線拍照、缺損手術區(qū)行骨密度測定及病理切片組織學分析，對各個不同時期骨缺損修復情況

4、進行評估。對實驗組及對照組的不同評估數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析、對比，從而證實兩種不同支架材料修復骨缺損的效果是否存在差異。
　　結果：
　　制備的 TGF-β1/殼聚糖緩釋微球的性狀：微球呈淡黃色粉末狀。掃描電鏡觀察到所制備的 TGF-β1殼聚糖微球基本呈類球形，大小均勻，直徑約為5μm，表面光滑，有較多微小孔隙，分散度較好。TGF-β1/殼聚糖緩釋微球的載藥量和包封率測定結果：共放入TGF-β1的量為5μg，TGF-β1殼聚糖微

5、球10mg溶解后制備得到的上清液樣本以人TGF-β1 ELISA試劑盒進行檢測，TGF-β1殼聚糖微球的載藥量為22.9μg/g，包封率為79.5%。TGF-β1殼聚糖微球體外釋放情況：在前12小時內(nèi)TGF-β1因子釋放速度較快，以后逐漸平緩，到第6天，TGF-β1殼聚糖微球釋放量為55.5%。
　　大體觀察：在手術后2周時，在實驗側手術部位支架材料的輪廓是清晰的，觸之感覺其硬度增加，其與兔橈骨的兩端連接部位連接牢固。而對照組支架

6、材料輪廓也清晰，局部觸之無明顯變硬，連接部位連接無實驗側牢固，但未出現(xiàn)移位情況；手術后第4周，切口處支架材料的輪廓已不明顯，實驗側手術部位已看不到輪廓。人工骨與宿主骨斷端間結合更加緊密，移植材料體表觸感質(zhì)地更加堅硬。對照側納米骨與宿主骨間連接緊密程度及堅硬程度較實驗組差；術后第6周，實驗側人工骨與宿主骨斷端間可捫及隆起骨痂，質(zhì)地變硬。對照側支架材料與橈骨交界處也可以觸及新形成的骨痂，但是其大小及硬度均不如實驗側；手術后第8周，實驗側支架

7、材料外部也變硬，形成包殼樣結構，支架材料與橈骨交界處形成的骨痂觸之更加堅硬，連接部位結合已十分牢固，對照側也可捫及硬的包殼及骨痂，但其硬度不如實驗側，其連接部位結合也比較牢固；手術后第12周，實驗側的支架材料處外部觸之已十分堅硬，交界處的骨痂已基本觸不到，手術區(qū)骨質(zhì)與宿主骨觸之已十分相似，對照側較實驗側為差。
　　X射線觀察：觀察內(nèi)容包括骨形成、骨連接及骨塑形3個方面11項內(nèi)容。實驗側在術后2周即有成骨表現(xiàn)，但成骨部分占骨缺損部分

8、比例不到25%，交界處可見少許骨痂形成，分界線模糊，未見骨塑形情況；對照側未見明顯成骨表現(xiàn)，交界處分界線清晰，無骨塑形情況。4周時實驗側有部分骨痂形成，成骨部分占骨缺損部分比例達到25%，但不足50%，交界處可見部分骨痂形成，分界線更為模糊，但未消失，未見明顯骨塑形情況；對照側可見成骨表現(xiàn)，但成骨部分占骨缺損部分比例不到25%，交界處分界線模糊，無骨塑形情況。6周時實驗側有大量骨痂形成，成骨部分占骨缺損部分比例達50%，但未超過75%，

9、植入骨與宿主骨接觸間隙極為模糊至基本消失，未見正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形；對照側成骨部分占骨缺損部分比例達到25%，但不足50%，交界處可見有少許骨痂形成，分界線已經(jīng)模糊，未見正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形。8周時實驗側骨痂進一步增加，成骨占骨缺損部分比例達75%以上，但骨缺損未完全愈合，植入骨與宿主骨接觸間隙基本消失，可見到髓腔樣結構形成但無皮質(zhì)骨塑形表現(xiàn)；對照側也有大量骨痂形成，成骨部分占骨缺損部分比例達50%，但未超過75%，植入骨與宿主

10、骨接觸間隙極為模糊，未見正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形。12周時實驗側骨缺損全部愈合，新生骨完全填充骨缺損部位，移植骨-宿主骨間隙完全消失，髓腔再通，皮質(zhì)骨已經(jīng)塑形成為成熟的板層骨；對照側骨痂進一步增加，新生骨占骨缺損部分比例達75%以上，但骨缺損未完全愈合，植入骨與宿主骨接觸間隙基本消失，可見到髓腔樣結構形成但無皮質(zhì)骨塑形表現(xiàn)。
　　骨密度測定：骨密度，全稱“骨骼礦物質(zhì)密度”。骨密度是骨質(zhì)量的一個重要標志。手術后第2周對實驗側骨缺損區(qū)

11、行骨密度測定，發(fā)現(xiàn)骨缺損區(qū)支架材料骨密度值比體外制備的納米支架材料骨密度值增高；并在隨后的第4周、第6周、第8周及第12周行骨密度測定，其數(shù)值均高于體外納米支架材料的骨密度數(shù)值，并且其骨密度值隨時間的增長而增高，尤其在術后第12周，骨缺損區(qū)的骨密度測定數(shù)據(jù)與實驗動物橈骨本身骨密度數(shù)值達到同一水平。而在實驗動物的對照側，骨缺損區(qū)的骨密度數(shù)值高于體外納米支架材料密度出現(xiàn)在術后第4周。在隨后的幾個時間段其骨缺損區(qū)骨密度數(shù)值也隨時間而增高，但是

12、即便在第12周時，缺損區(qū)骨密度數(shù)值也低于實驗動物橈骨本身的骨密度數(shù)值。
　　組織學觀察：實驗側在術后2周即表現(xiàn)活躍成骨，成骨類細胞增加，局部開始出現(xiàn)細胞外基質(zhì)沉積，對照組的成骨活躍程度較實驗組要差；復合支架材料的實驗組在手術后第2周病理切片局部可以觀察到在材料周邊有骨痂形成，隨時間推移，在以后的第4周、第6周、第8周時間段，骨痂的數(shù)量逐漸增多，組織學結構“骨單位”開始形成并出現(xiàn)，骨單位逐漸增多并成熟。納米支架材料在體內(nèi)逐漸被降解、

13、吸收，破骨細胞對新生骨進行改建，髓腔結構逐漸形成，在手術后的第12周，骨單位均已十分成熟，大量板層骨在骨缺損區(qū)形成，板層骨已經(jīng)取代了排列雜亂的新生骨，髓腔再通，局部骨缺損得以修復，新骨與宿主骨已完全結合，塑形完成。單純支架材料的對照側在材料周邊病理切片觀察到新生骨出現(xiàn)在手術后第4周，其進程與實驗側成骨進程相似，但在同一時間段，對照側的成骨數(shù)量及新生骨的成熟度均較實驗側差，在術后第12周時，雖然出現(xiàn)的骨單位結構也逐漸成熟，并且逐漸增多的大

14、量骨痂填充骨缺損區(qū)，但新骨的改建及塑形還沒有完成，髓腔結構剛剛開始形成，沒有形成大量成熟的板層骨。
　　結論：
　　1.采用乳化交聯(lián)方法制備復合轉(zhuǎn)化生長因子β1的殼聚糖緩釋微球的方法簡便易行，成球性好，獲取率高，具有優(yōu)良的緩釋效果。
　　2. TGF-β1對創(chuàng)傷、腫瘤、先天畸形等原因?qū)е碌墓侨睋p的修復、骨組織的生長等方面發(fā)揮著積極的效應。其發(fā)揮效應的機制是TGF-β1對成骨細胞的增殖、分化、微血管形成及細胞外基質(zhì)的形成