基質(zhì)細(xì)胞衍生因子促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域定向遷移的研究.pdf

1、目的：
　　本研究的目的在于探究SDF-1對(duì)于誘導(dǎo)ADSCs向創(chuàng)傷組織定向趨化遷移的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證通過(guò)調(diào)控SDF-1的局部濃度控制ADSCs向創(chuàng)傷組織的趨化遷移是否可行，為充分動(dòng)員ADSCs發(fā)揮促修復(fù)作用尋找新策略，對(duì)于干細(xì)胞療法的廣泛應(yīng)用也具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
　　方法：
　　1.采用改良的酶消化法分離獲得SD大鼠ADSCs，經(jīng)體外培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞表面C

2、D29、CD34、CD45及CD90的表達(dá)，體外誘導(dǎo)細(xì)胞成脂成骨分化檢測(cè)其多向分化能力。
　　2.構(gòu)建攜帶eGFP基因的慢病毒載體，以經(jīng)驗(yàn)感染復(fù)數(shù)MOI=40轉(zhuǎn)染第3代ADSCs，并且分別于轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h、96h時(shí)，于熒光顯微鏡下觀察ADSCs的綠色熒光蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況，并于轉(zhuǎn)染一周后，使用流式細(xì)胞檢測(cè)ADSCs的eGFP陽(yáng)性表達(dá)率。繼續(xù)傳代轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞至第九代，于熒光顯微鏡下觀察，驗(yàn)證隨著細(xì)胞的增殖傳代，eGF

3、P是否可以穩(wěn)定表達(dá)。用MTT法檢測(cè)Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后ADSCs的細(xì)胞活性。對(duì)eGFP-ADSCs進(jìn)行成脂成骨誘導(dǎo)分化，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞是否仍具備多向分化能力，且驗(yàn)證分化后的eGFP-ADSCs是否仍可表達(dá)綠色熒光蛋白（eGFP）。
　　3.利用含有SDF-1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)體外傳代至第3代的ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)2天后，流式細(xì)胞技術(shù)及蛋白質(zhì)印跡分析法檢測(cè)其細(xì)胞中SDF-1受體CXCR4及CXCR7的表達(dá)情況，并與正常

4、傳代培養(yǎng)的第3代ADSCs進(jìn)行比較。
　　4.構(gòu)建Transwell細(xì)胞遷移模型，檢測(cè)體外SDF-1對(duì)ADSCs遷移的影響，并且設(shè)置SDF-1的濃度梯度為0ug/L、1ug/L、10ug/L、100ug/L，檢測(cè)1-100ug/L濃度范圍內(nèi)，.ADSCs的遷移與SDF-1,濃度有無(wú)相關(guān)性。
　　5.構(gòu)建大鼠背部創(chuàng)傷模型，通過(guò)動(dòng)脈移植途徑向動(dòng)物模型中注入eGFP-ADSCs，設(shè)置空白對(duì)照組(未做創(chuàng)傷處理，僅移植eGFP-ADS

5、Cs)、創(chuàng)傷組（大鼠背部創(chuàng)傷+eGFP-ADSCs移植）、SDF-1干預(yù)組（大鼠背部創(chuàng)傷+eGFP-ADSCs移植+局部SDF-1給藥）。定期取大鼠背部創(chuàng)傷組織，利用Elisa法檢測(cè)創(chuàng)傷組織中SDF-1在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì);利用RT-PCR檢測(cè)創(chuàng)傷組織中eGFP基因的表達(dá)情況，并在共聚焦顯微鏡下觀察eGFP-ADSCs在創(chuàng)傷組織冰凍切片中的遷移分布情況。定期采集大鼠循環(huán)血，利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)及RT-PCR法，對(duì)eGFP-ADSCs動(dòng)

6、員入循環(huán)血的情況加以分析。并于細(xì)胞移植后的21d，分別取三組大鼠血供豐富、氧分壓較高的實(shí)質(zhì)性器官——肺組織，進(jìn)行冰凍切片，于共聚焦纖維鏡下觀察eGFP-ADSCs在肺部組織中的分布，利用RT-PCR檢測(cè)肺組織中eGFP基因的表達(dá)情況。
　　6.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別于創(chuàng)傷后1d、3d、7d、14d、21d，觀察記錄兩組創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)面愈合的情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合率;并于創(chuàng)傷后7d采集兩組大鼠創(chuàng)面組織進(jìn)行CD31免疫組化染色，比較兩組創(chuàng)面組織中毛

7、細(xì)血管密度。
　　結(jié)果：
　　1.倒置顯微鏡下觀察，分離培養(yǎng)的大鼠ADSCs呈梭型或多角形，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)ADSCs表面高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29、CD90;基本不表達(dá)造血及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物標(biāo)記物CD34、CD45。體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，油紅O染色陽(yáng)性，證明其具有成脂分化能力;體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28d后，茜素紅染色陽(yáng)性，證明其具有成骨分化的能力。
　　2.Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染第3代ADS

8、Cs，96h時(shí)，細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)程度達(dá)到高峰，此后維持在較高水平穩(wěn)定表達(dá)。連續(xù)傳代培養(yǎng)至第9代，細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況仍無(wú)明顯變化。轉(zhuǎn)染一周后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后ADSCs的eGFP陽(yáng)性表達(dá)率為81.92％(圖2-4)，可滿足本實(shí)驗(yàn)的需求。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后的ADSCs與未轉(zhuǎn)染的ADSCs在細(xì)胞活性方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)eGFP-ADSCs進(jìn)行多向分化能力檢測(cè)，體

9、外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，油紅O染色陽(yáng)性，體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28d后，茜素紅染色陽(yáng)性，證明慢病毒轉(zhuǎn)染并未對(duì)其多向分化能力造成影響。
　　3.流式細(xì)胞結(jié)果顯示，ADSCs在體外培養(yǎng)傳至第3代(P3 ADSCs)，其表面SDF-1受體CXCR4、CXCR7的陽(yáng)性表達(dá)率很低，分別為3.0％、4.1％，經(jīng)SDF-1處理2d后，P3 ADSCs表面CXCR4、CXCR7的陽(yáng)性表達(dá)率明顯上調(diào)至33.7％、26.4％。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)

10、果同流式細(xì)胞結(jié)果基本一致，P3 ADSCs中CXCR4與CXCR7表達(dá)水平較低，經(jīng)SDF-1處理后表達(dá)明顯提高。因此說(shuō)明經(jīng)SDF-1誘導(dǎo)可有效提高傳代后ADSCs表面CXCR4與CXCR7的表達(dá)水平。
　　4.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)下室加入SDF-1后，ADSCs細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增加，SDF-1濃度為0ug/L、1ug/L、10ug/L、100ug/L時(shí)，ADSCs的細(xì)胞遷移率分別為9.77％、13.45％、28.1

11、4％、49.14％，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，證明了SDF-1在體外對(duì)ADSCs的遷移有誘導(dǎo)作用，且在0-100ug/L的范圍內(nèi)，誘導(dǎo)作用呈正相關(guān)關(guān)系，即SDF-1濃度越高ADSCs遷移越明顯。
　　5.Elisa法檢測(cè)組織中SDF-1含量顯示，未致創(chuàng)大鼠所取的組織中即正常皮膚組織亦構(gòu)成性地表達(dá)SDF-1，但表達(dá)水平較低，在皮膚致創(chuàng)后即刻至第24h，創(chuàng)傷組織中SDF-1水平呈上調(diào)趨勢(shì)，24h時(shí)出現(xiàn)SDF-1水平的小高

12、峰，此后在24h-72h間，SDF-1的表達(dá)略有下調(diào)，72h-7d間SDF-1水平重又上開，7d時(shí)達(dá)到整個(gè)愈傷過(guò)程的最高峰，隨后SDF-1水平隨創(chuàng)傷的愈合逐漸下降。經(jīng)外源性SDF-1干預(yù)后，創(chuàng)傷組織SDF-1水平在24h-7d間呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，未出現(xiàn)明顯波動(dòng)，7d后直至21d，隨創(chuàng)面愈合，SDF-1水平顯著下降。
　　6.共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞移植后的第1天，eGFP-ADSCs開始少量出現(xiàn)在大鼠創(chuàng)傷組織中，隨著時(shí)間的遷移，

13、eGFP-ADSCs細(xì)胞量逐漸增多，并大致分布于表皮組織、腺體及血管周圍。我們利用ImagePro Plus圖像軟件對(duì)切片綠熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，SDF-1干預(yù)過(guò)的創(chuàng)傷大鼠，其創(chuàng)面組織中eGFP-ADSCs的含量在3d、7d、14d及21d均高于未予SDF-1干預(yù)的創(chuàng)傷大鼠。RT-PCR檢測(cè)各組創(chuàng)傷組織中eGFP基因的表達(dá)情況，其結(jié)果與冰凍切片的觀察結(jié)果基本吻合。細(xì)胞移植后第21d，對(duì)各組大鼠的肺部組織取材進(jìn)行冰凍切片及RT-PC

14、R檢測(cè)，結(jié)果顯示，未創(chuàng)傷大鼠肺組織中eGFP-ADSCs含量較另外兩組明顯較多，其中SDF-1干預(yù)的創(chuàng)傷大鼠肺組織中eGFP-ADSCs含量最少。
　　7.流式細(xì)胞分析結(jié)果提示，創(chuàng)傷組大鼠及SDF-1干預(yù)的創(chuàng)傷組大鼠與空白對(duì)照組大鼠相比，循環(huán)血中eGFP-ADSCs含量較多;RT-PCR檢測(cè)循環(huán)血中eGFP基因表達(dá)情況顯示，各時(shí)間點(diǎn)循環(huán)血中eGFP基因的表達(dá)情況:SDF-1干預(yù)的創(chuàng)傷組大鼠＞創(chuàng)傷組大鼠＞對(duì)照組大鼠。
　　8.

15、移植ADSCs的創(chuàng)傷大鼠在給予外源性SDF-1處理后，其創(chuàng)面愈合速度較未予SDF-1處理的加快，SDF-1處理組的創(chuàng)面愈合率在傷后7d、14d均高于對(duì)照組。創(chuàng)傷后7d，取大鼠創(chuàng)面組織進(jìn)行CD31免疫組化染色，結(jié)果顯示，SDF-1處理后的創(chuàng)傷組織中毛細(xì)血管密度明顯高于未予SDF-1處理的創(chuàng)傷組織。
　　結(jié)論：
　　1.利用攜帶eGFP基因的慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs獲得eGFP標(biāo)記的ADSCs，可穩(wěn)定表達(dá)eGFP綠色熒光，且不受細(xì)胞

16、傳代增殖分化的影響，轉(zhuǎn)染后ADSCs的生物學(xué)特性亦未受明顯影響，因此可滿足動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的需求。
　　2.體外培養(yǎng)傳代的ADSCs至P3(第三代)時(shí)，其表面SDF-1受體CXCR4及CXCR7的陽(yáng)性表達(dá)率很低，但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入SDF-1誘導(dǎo)培養(yǎng)2d后，其表面CXCR4及CXCR7的陽(yáng)性表達(dá)率可明顯提高。在體外，SDF-1可促進(jìn)ADSCs的跨膜遷移，在0-100ug/L的范圍內(nèi)，隨SDF-1濃度的提高，ADSCs的遷移越明顯。