堿性成纖維生長因子對脂肪干細(xì)胞向血管內(nèi)皮遷移的影響.pdf

1、研究目的：
　　本實驗?zāi)康脑谟谟^察外源性堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)對植入小鼠皮下的人脂肪來源干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells，hASCs)-透明質(zhì)酸鈉復(fù)合物中人脂肪來源干細(xì)胞向血管內(nèi)皮遷移情況的影響，由此探究一種較為理想的軟組織填充方案。
　　材料與方法：
　　由鄭大五附院行脂肪抽吸術(shù)的健康求美者獲得脂肪混懸液，用

2、膠原酶消化混懸液后，從中分離、提取出hASCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增，用顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，用臺盼藍(lán)染液對其進(jìn)行染色后行hASCs計數(shù)，再用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定。將傳代至第三代的細(xì)胞行成脂誘導(dǎo)，并行油紅O染色對其進(jìn)行成脂鑒定。用cm-dil標(biāo)記第三代細(xì)胞并在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記后細(xì)胞形態(tài)。取第3代鑒定過后的hASCs進(jìn)行cm-dil熒光標(biāo)記，標(biāo)記后制成5×109L-1的細(xì)胞懸液。將bFGF配成2mg/L的工作液。將0.25m

3、l透明質(zhì)酸鈉凝膠、0.2ml細(xì)胞懸液和0.05ml含有bFGF的工作液混合制成實驗組植入物，同時將0.25ml透明質(zhì)酸鈉凝膠、0.2ml細(xì)胞懸液和0.05mlDMEM對照液混合制成對照組植入物，將實驗組、對照組分別植入小鼠背部左、右兩側(cè)皮下，每只小鼠均作自身對照。6周后取材，觀察局部注射物吸收情況及組織大體形態(tài)，蘇木精-伊紅染色后觀察組織學(xué)形態(tài)，免疫熒光標(biāo)記后熒光顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮熒光及外源性人脂肪來源干細(xì)胞示蹤熒光。觀察并記錄實驗組

4、、對照組同一視野FITC標(biāo)記血管內(nèi)皮的綠色熒光和cm-dil標(biāo)記外源性人脂肪來源干細(xì)胞的紅色熒光的重合例數(shù)，并行統(tǒng)計學(xué)分析比較兩組差異。
　　結(jié)果：
　　1.提取并傳代培養(yǎng)的人脂肪來源干細(xì)胞光鏡下形態(tài)為梭形，流式細(xì)胞儀檢測其表型符合人脂肪來源干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，行成脂誘導(dǎo)后7天可在鏡下觀察到大小不一的脂滴，油紅O染色結(jié)果為陽性。經(jīng)cm-dil標(biāo)記后，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞顯紅色熒光，呈梭形。
　　2.攜帶外源性人脂肪來源干細(xì)胞的

5、實驗組、對照組復(fù)合物植入小鼠體內(nèi)后未見排異反應(yīng)。術(shù)后6周剪開背部皮膚，見雙側(cè)植入處均無結(jié)節(jié)、壞死、液化，無明顯凝膠狀物殘留，雙側(cè)軟組織質(zhì)地?zé)o顯著差別。
　　3.蘇木精-伊紅染色后鏡下可見兩組標(biāo)本性質(zhì)主要為脂肪組織和疏松結(jié)締組織，并可觀察到血管和肌肉組織。實驗組與對照組標(biāo)本經(jīng)蘇木精-伊紅染色后組織成分鏡下未見明顯差異。
　　4.熒光顯微鏡綠色光源下可見顆粒狀聚集或條帶狀沉積的紅色明亮熒光，藍(lán)色光源下可見血管內(nèi)皮細(xì)胞呈綠色熒光，

6、形態(tài)多為血管斷面。綠色光源下隨機(jī)選取標(biāo)記外源性人脂肪來源干細(xì)胞的紅色熒光，切換藍(lán)色光源觀察有否標(biāo)記血管內(nèi)皮的綠色熒光與之重合，結(jié)果兩組重合例數(shù)實驗組大于對照組，卡方值x2=4.53，自由度v=1，P＜0.05，差異有顯著性意義。
　　結(jié)論：
　　將堿性成纖維生長因子加入人脂肪來源干細(xì)胞-透明質(zhì)酸鈉支架復(fù)合物中植入小鼠體內(nèi)后，堿性成纖維細(xì)胞生長因子可促進(jìn)植入物中的外源性人脂肪來源干細(xì)胞向血管內(nèi)皮遷移，參與血管的構(gòu)建及新生，加強(qiáng)