SOX5維持非小細胞肺癌惡性表型的作用機制研究.pdf

1、目的：肺癌是發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)所占比率最高。腫瘤細胞自我更新、快速增殖、高侵襲遷移能力等惡性表型是NSCLC局部復發(fā)和遠處轉移的根本原因。因此，深入研究NSCLC惡性表型的維持機制，為闡明NSCLC的發(fā)生發(fā)展機制，尋找特異性治療靶點具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子SOX2能與Hippo信號通路中的關鍵效應分子YAP1相互作用促進惡性腫瘤的進

2、展。性別決定區(qū)Y框蛋白5(Sex determining region Y-box5，SOX5)同屬于SOX超基因家族中的一員，其也異常表達于多種腫瘤并能促進腫瘤細胞的增殖、侵襲遷移等多種惡性表型，但SOX5在NSCLC中的表達情況及其在腫瘤發(fā)生演進中發(fā)揮的作用目前尚不清楚。因此，本研究旨在探討SOX5在NSCLC中的表達情況及其在維持NSCLC惡性表型中發(fā)揮的作用及其潛在的機制。
　　方法：在GEO數(shù)據(jù)庫中分析SOX5的表達與N

3、SCLC患者的預后關系，應用定量實時多聚酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)和Western blot檢測SOX5在人支氣管上皮樣細胞（human bronchial epithelial cells，HBE）和3種NSCLC細胞株(A549、H1299、H1975)以及腫瘤球與單層腫瘤細胞中的表達情況。采用慢病毒感染A549和H1975細胞，經qR

4、T-PCR和Western blot驗證干擾效率，構建SOX5敲低和過表達穩(wěn)定細胞株。分別應用克隆形成實驗、CCK-8實驗、成球試驗、transwell細胞侵襲實驗、劃痕實驗和免疫熒光偽足染色探討敲低和過表達SOX5后對A549和H1975細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，同時采用Western blot探討敲低和過表達SOX5后對細胞干性標志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵襲、遷移相關蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的影響

5、。進一步在裸鼠皮下注射敲低SOX5-A549細胞建立移植瘤模型，測定瘤體大小和重量，免疫組化檢測瘤體內SOX5、YAP1、SOX2和MMP2的表達情況。應用成球試驗、transwell細胞侵襲實驗、劃痕實驗和免疫熒光偽足染色探討YAP1對NSCLC惡性表型的影響，Western blot探討敲低YAP1后對干性標志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵襲、遷移相關蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的影響。機制上，應用免疫共沉淀(C

6、o-Immunoprecipitation，Co-IP)、細胞免疫熒光染色及核漿分離實驗驗證與SOX5相互作用的蛋白。同時在敲低YAP1-A549細胞中過表達SOX5探究SOX5是否可拯救敲低YAP1所發(fā)揮的效應。
　　結果：1.通過GEO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)高表達SOX5的NSCLC患者預后不良;qRT-PCR和Western blot中，SOX5均高表達于3種NSCLC細胞株而低表達于HBE，且相對于單層細胞，SOX5在腫瘤球里表達

7、量更高。2.慢病毒感染A549和H1975細胞后，qRT-PCR和Western blot顯示敲低SOX5后SOX5表達降低，而過表達SOX5后SOX5表達上調，成功構建SOX5敲低和過表達穩(wěn)定細胞株。3.克隆形成實驗和CCK-8實驗顯示：敲低SOX5后克隆形成體積變小，數(shù)量減少，細胞增殖活性減弱，過表達SOX5后克隆形成體積增大，數(shù)量增多，細胞增殖活性增強。4.成球試驗顯示：敲低SOX5后A549和H1975細胞形成的腫瘤球體積變小，

8、數(shù)量減少，過表達SOX5后形成的腫瘤球體積增大，數(shù)量增多。5.Transwell細胞侵襲實驗、劃痕實驗和免疫熒光偽足染色實驗顯示：敲低SOX5后A549和H1975細胞通過transwell小室侵襲細胞減少，傷口愈合率減慢，并減少了偽足的生成，過表達SOX5后通過transwell小室侵襲細胞增多，傷口愈合率加快，偽足生成增加。6.Western blot顯示：敲低SOX5后干性標志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵襲和遷移相關蛋白

9、MMP2、VIMENTIN、SLUG的表達下調，過表達SOX5后這些蛋白的表達增加。7.體外實驗顯示敲低SOX5可減慢NSCLC細胞移植瘤生長速度和減小腫瘤體積，移植瘤免疫組化提示敲低SOX5后YAP1、SOX2和MMP2的表達減少。8.NSCLC細胞中敲低YAP1后，NSCLC細胞成球能力減弱，通過transwell小室的細胞減少，劃痕愈合的速率減慢，細胞侵襲性偽足減少。Western blot顯示：敲低YAP1后干性標志物OCT4、

10、NANOG、SOX2以及侵襲和遷移相關蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的表達下調。9.SOX5和YAP1均在腫瘤球里高表達，Western blot顯示：YAP1的表達隨著SOX5的改變而發(fā)生相應改變，而YAP1的下調也可引起SOX5的下調。10.Co-IP實驗顯示在NSCLC細胞中SOX5與YAP1形成復合物相互作用，免疫熒光實驗顯示SOX5與YAP1在細胞核共定位，核漿分離實驗顯示：過表達SOX5可增加YAP1進入細胞核，而