三維超分辨率顯微成像系統(tǒng)與分析方法研究.pdf

1、光學(xué)顯微鏡以及熒光顯微鏡的特異性，非侵入性以及能夠進(jìn)行活細(xì)胞多色成像等特性，使其在生物學(xué)研究中具有很重要的作用。同時(shí)由于光具有的衍射特性，光學(xué)成像設(shè)備都存在分辨率極限。對(duì)于光學(xué)顯微鏡來(lái)說(shuō)，分辨率在側(cè)向能夠達(dá)到200nm，軸向達(dá)到500nm左右。而近年來(lái)發(fā)展的超分辨顯微成像技術(shù)能夠突破傳統(tǒng)熒光顯微鏡的衍射極限限制，分辨率達(dá)到幾十納米甚至幾納米范圍，拓展了熒光顯微鏡在細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)，相關(guān)蛋白分布以及相互作用的相關(guān)研究中的應(yīng)用。超分辨顯微鏡在近

2、幾年取得了很大成功，與此同時(shí)如何得到更高的空間以及時(shí)間分辨率成為接下來(lái)的研究方向。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、沤榻B了單分子熒光干涉測(cè)量超分辨顯微成像系統(tǒng)。通過(guò)利用單分子熒光干涉測(cè)量的方法達(dá)到提高單分子軸向定位精度的目的。對(duì)于熒光成像技術(shù)來(lái)說(shuō)，三維成像能夠得到細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的更多信息。通常對(duì)于光學(xué)顯微鏡以及超分辨顯微成像技術(shù)而言，能夠達(dá)到的軸向定位精度通常低于側(cè)向定位精度。現(xiàn)在常用的單分子軸向定位方法包括雙層成像法，柱面鏡法以及DH-P

3、SF系統(tǒng)。這些方法都是通過(guò)改變點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的形狀來(lái)達(dá)到對(duì)Z軸位置進(jìn)行定位的目的。另外還有使用熒光干涉測(cè)量方法的iPALM和4Pi-SMS等方法，通過(guò)使用雙物鏡以及熒光干涉的方法達(dá)到更高的軸向定位精度。但是這兩種方法系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，成本較高，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室建成類似的系統(tǒng)。我們通過(guò)比較幾種顯微技術(shù)，設(shè)計(jì)并搭建了單分子干涉成像顯微鏡，稱為piPALM。我們?cè)谙到y(tǒng)中通過(guò)使用通用部件降低了系統(tǒng)成本，在保持了熒光干涉的軸向高定位精度特性的同時(shí)，使得搭

4、建過(guò)程更簡(jiǎn)單。在第二章中詳細(xì)介紹了系統(tǒng)的軟硬件開(kāi)發(fā)以及搭建調(diào)試過(guò)程。成像結(jié)果表明，我們的系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)單分子熒光干涉測(cè)量軸向位置，在三維方向上都能夠達(dá)到20nm以下的分辨率。
　?、平榻B了對(duì)受限運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的單分子進(jìn)行建模并分析其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)對(duì)定位精度的影響。同時(shí)開(kāi)發(fā)了基于人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)算法的單分子定位算法，能夠消除單分子點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)不對(duì)稱性對(duì)定位精度的影響，具有更高的魯棒性以及計(jì)算速度。對(duì)于單分子定位超分辨顯微技術(shù)來(lái)說(shuō)，單分子定位方法具有很

5、重要作用。常用的單分子定位算法包括最小二乘法以及極大似然法。這兩種方法在擬合計(jì)算時(shí)使用的模型都是二維高斯函數(shù)。當(dāng)單分子的運(yùn)動(dòng)受限制或者完全固定時(shí)，它的圖像會(huì)變得不對(duì)稱，這時(shí)使用高斯函數(shù)作為擬合模型進(jìn)行擬合就會(huì)產(chǎn)生很大的定位誤差，而離焦時(shí)會(huì)造成更大的定位誤差。在本文中，我們首次提出了限制運(yùn)動(dòng)偶極子模型以及理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。其次，由于理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的數(shù)值計(jì)算過(guò)程很復(fù)雜，不適合使用傳統(tǒng)的擬合算法進(jìn)行參數(shù)估計(jì)，我們?cè)谌斯ど窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)算法基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了單

6、分子定位算法，在保持較高的精度的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了更高的計(jì)算效率。對(duì)模擬數(shù)據(jù)和細(xì)胞樣品數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，我們方法的定位誤差受單分子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)以及離焦等情況的影響小于傳統(tǒng)的單分子定位算法，能夠有效減小因?yàn)閱畏肿舆\(yùn)動(dòng)狀態(tài)以及離焦等因素導(dǎo)致的定位誤差，實(shí)現(xiàn)更高的單分子定位精度。
　?、墙榻B了高密度單分子數(shù)據(jù)分析方法，通過(guò)將壓縮感知算法與雙層面成像技術(shù)的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了高密度單分子三維定位分析，同時(shí)減小了圖像采集時(shí)間?；趩畏肿佣ㄎ坏某直骘@微技術(shù)能

7、夠達(dá)到很高的分辨率，但是由于成像原理的限制，需要收集到足夠的單分子進(jìn)行圖像重構(gòu)，因此樣品成像的時(shí)間較長(zhǎng)，通常實(shí)驗(yàn)中成像時(shí)間幾分鐘到幾十分鐘左右。減少圖像采集時(shí)間的方法之一就是提高每一幀圖像中的單分子數(shù)量，但單分子密度的提高會(huì)使得單分子之間發(fā)生重疊。通過(guò)比較幾種常用的高密度單分子圖像分子方法，包括 DAO-STORM和壓縮感知算法，發(fā)現(xiàn)壓縮感知算法的性能最好。同時(shí)為了實(shí)現(xiàn)三維單分子定位而又不影響單分子圖像的形狀，采用了雙層面成像技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)

8、Z軸定位。模擬數(shù)據(jù)以及細(xì)胞樣品的成像數(shù)據(jù)分析顯示，我們的算法能夠達(dá)到10μm-1的單分子密度，同時(shí)分辨率能夠達(dá)到50nm。重構(gòu)一幅圖像只需要300幀原始圖像，將采集時(shí)間縮短到了6秒以下。分別討論了使用硬件以及軟件的方法提高超分辨顯微技術(shù)的軸向，側(cè)向以及時(shí)間分辨率的方法原理，實(shí)現(xiàn)過(guò)程以及分析結(jié)果。在實(shí)際使用中，空間分辨率與時(shí)間分辨率之間會(huì)相互影響，在實(shí)際使用過(guò)程中就需要根據(jù)研究需要找到它們之間的最佳平衡點(diǎn)。本文中討論的三個(gè)部分工作都是圍繞