裝載不同功能RNA的重組MS2病毒樣顆粒的原核表達(dá)及應(yīng)用研究.pdf

1、2014年西非爆發(fā)的埃博拉出血熱疫情在全世界范圍引起廣泛關(guān)注。中國(guó)與西非往來密切，疫情爆發(fā)期間，埃博拉病患自境外輸入中國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)較高且持續(xù)存在。提高該病毒的早期準(zhǔn)確檢測(cè)能力，成為我國(guó)防控埃博拉疫情的關(guān)鍵。
　　為提高全國(guó)范圍，特別是重要港口城市，具備埃博拉病毒檢測(cè)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)等對(duì)該病毒的檢測(cè)能力，2014年12月衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織開展相關(guān)質(zhì)量評(píng)價(jià)工作。鑒于埃博拉病毒屬于生物安全四級(jí)防控病毒，一旦感染具有極高的致死性

2、，常規(guī)利用滅活病毒或感染病人陽性血清制備質(zhì)控品的方法不適用于本次質(zhì)量評(píng)價(jià)。因此，我們選擇生物安全性高、穩(wěn)定性好、對(duì)RNA保護(hù)作用強(qiáng)的噬菌體MS2病毒樣顆粒（Bacteriophage MS2 virus-like particles，MS2 VLPs），制備包裹2014年西非流行株扎伊爾型埃博拉病毒核衣殼蛋白(Nucleoprotein，NP)RNA全長(zhǎng)、包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）及RNA依賴的RNA聚合酶L(Poly

3、merase)部分RNA序列的重組MS2 VLPs質(zhì)控品，對(duì)各參評(píng)機(jī)構(gòu)進(jìn)行發(fā)放。
　　在19家參評(píng)機(jī)構(gòu)回報(bào)的20份結(jié)果中（其中一家機(jī)構(gòu)回報(bào)了NP及GP/L雙靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果），14家機(jī)構(gòu)(73.68％)回報(bào)完全正確，3家機(jī)構(gòu)(15.79％)出現(xiàn)一個(gè)假陰性結(jié)果，1家(5.26％)出現(xiàn)兩個(gè)假陰性結(jié)果，剩余1家機(jī)構(gòu)(5.26％)回報(bào)錯(cuò)誤結(jié)果超過3個(gè)。本次質(zhì)評(píng)樣本盤中全部陰性樣本結(jié)果回報(bào)正確，上述錯(cuò)誤回報(bào)結(jié)果主要集中在對(duì)弱陽性樣本的檢出方面。

4、針對(duì)本次質(zhì)量評(píng)價(jià)中存在的假陰性問題，我們提出使用商品化試劑盒或國(guó)家CDC提供的標(biāo)準(zhǔn)引物、探針檢測(cè)，使用雙靶標(biāo)檢測(cè)方法，以及對(duì)操作人員規(guī)范化培訓(xùn)、及時(shí)校準(zhǔn)儀器等改進(jìn)意見。本次質(zhì)評(píng)工作促進(jìn)了各參評(píng)機(jī)構(gòu)埃博拉病毒核酸檢測(cè)能力的提高，在疫情爆發(fā)階段有效防控了埃博拉病毒流入中國(guó)。
　　在第二部分中，為解決之前基于MS2 VLP的miRNA遞送體系中，化學(xué)交聯(lián)方法存在的成功率低、成本高、周期長(zhǎng)、步驟繁瑣等問題，我們采用噬菌體表面展示技術(shù)，制備

5、了表面展示細(xì)胞穿透肽TAT內(nèi)含pre-miR122的重組MS2 VLPs用于肝癌治療研究。
　　我們首先明確上述展示TAT的VLPs是否具備細(xì)胞膜穿透功能及遞送miR122的能力。為進(jìn)一步檢測(cè)內(nèi)含pre-miR122表面展示TAT的MS2 VLPs對(duì)肝細(xì)胞癌的抑制效果，我們同時(shí)制備了內(nèi)含pre-miR122表面化學(xué)交聯(lián)TAT的MS2 VLPs做為對(duì)比。通過CCK8、transwell小室、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot及CT

6、影像學(xué)分析、HE染色、免疫組化等方法，在細(xì)胞及動(dòng)物水平明確上述兩種VLPs對(duì)肝癌的抑制效果及是否存在差異。
　　結(jié)果證明，內(nèi)含pre-miR122表面展示TAT的MS2 VLPs可成功穿透細(xì)胞膜，實(shí)現(xiàn)miR122的高效胞內(nèi)遞送。應(yīng)用表面展示TAT及化學(xué)交聯(lián)TAT的VLPs處理Hep3B、HepG2及Huh7三種肝癌細(xì)胞后可發(fā)現(xiàn)，上述兩種內(nèi)含pre-miR122的VLPs對(duì)三種細(xì)胞均存在抑制作用，且表面展示TAT的VLPs抑制效果更

7、加明顯。繼而我們選擇Hep3B細(xì)胞（VLPs處理后細(xì)胞水平腫瘤抑制效果最明顯）建立肝癌動(dòng)物模型。對(duì)荷瘤組小鼠尾靜脈注射上述兩種VLPs后發(fā)現(xiàn)，表面展示TAT及化學(xué)交聯(lián)TAT內(nèi)含pre-miR122的VLPs均可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，且以前者抑制效果更明顯。以上結(jié)果提示，我們制備的基于表面展示TAT的重組MS2 VLP miR122遞送載體具有細(xì)胞穿透功能，體內(nèi)、體外均對(duì)肝細(xì)胞癌具有抑制作用。與化學(xué)交聯(lián)TAT內(nèi)含pre-miR122的VLPs