內(nèi)含特定RNA的MS2病毒樣顆粒的原核和真核表達(dá)及應(yīng)用研究.pdf

1、本文針對(duì)目前病毒樣顆粒(Virus-like particles.VLPs)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)——內(nèi)含特定RNA的MS2VLPs的原核和真核表達(dá)及應(yīng)用研究?jī)蓚€(gè)重要問題進(jìn)行探討，共由兩部分研究組成。
　　 手足口病(hand foot and mouth disease.HFMD)是由腸道病毒感染導(dǎo)致的臨床癥候群，是全球性傳染病，全世界大部分地區(qū)均有該病流行的文獻(xiàn)報(bào)道。腸道71型病毒(enterovirus 71，EV71)與柯薩奇

2、16型病毒(coxsackievirus A16.CA16)感染交替出現(xiàn)，成為HFMD的主要病原體。目前廣泛用于手足口病毒(hand foot and mouth virus.HFMV)核酸檢測(cè)的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品多為質(zhì)粒、滅活病毒、經(jīng)特殊處理的RNA和患者陽(yáng)性血清。它們具有易被核糖核酸酶(ribonulcease，RNase)降解、具有生物傳染危險(xiǎn)性、穩(wěn)定性較差和異質(zhì)性等缺點(diǎn)。因此，我們應(yīng)用傳統(tǒng)的MS2噬菌體克隆程序，表達(dá)一種耐RNase

3、的內(nèi)嵌腸道病毒RNA通用片段和HFMVRNA片段的嵌合型MS2VLPs，作為腸道病毒和HFMV核酸檢測(cè)的新型質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品。笫一部分旨在研究?jī)?nèi)含HFMVRNA的MS2VLPs的原核表達(dá)及其作為病毒核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本的應(yīng)用研究。本研究構(gòu)建了包含了三段靶序列（EV71-VLPs和EV-VLPs靶序列均來(lái)自EV71病毒，CA16-VLPs靶序列來(lái)自CA16病毒，其中EV-VLPs靶序列為腸道病毒通用序列）的三個(gè)VLPs，這些VLPs經(jīng)過

4、穩(wěn)定性和安全性等一系列的特征鑒定和驗(yàn)證后，用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品予以賦值，并且將其應(yīng)用于評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EV71和CA16病毒核酸的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(External quality assessment，EQA)。EQA血清盤由20個(gè)樣本組成，包括由不同濃度EV-VLPs和不同濃度的EV71-VLPs或CA16-VLPs的組合成的14份陽(yáng)性標(biāo)本，2份這三種VLPs組成的模擬EV71和CA16混合感染標(biāo)本，和4份陰性樣本。這20份標(biāo)本（內(nèi)附指導(dǎo)說(shuō)明）

5、通過快遞常溫運(yùn)送至全國(guó)54個(gè)負(fù)責(zé)HFMV分子檢測(cè)的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，要求其在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，采用其實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)所用的方法進(jìn)行檢測(cè)后，按要求回報(bào)結(jié)果。
　　 研究結(jié)果表明，我們通過分子克隆和原核表達(dá)方法，成功構(gòu)建了表達(dá)內(nèi)含HFMVRNA的三個(gè)VLPs，VLPs經(jīng)過一系列特征驗(yàn)證，具有耐RNA酶、無(wú)生物傳染危險(xiǎn)性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。這些VLPs作為病毒替代物首次應(yīng)用于全國(guó)HFMV檢測(cè)的EQA。我們共收到來(lái)自41個(gè)參與實(shí)驗(yàn)室的41份反饋檢測(cè)報(bào)

6、告，結(jié)果表明87.8％(36/41)實(shí)驗(yàn)室使用的是商品檢測(cè)試劑盒（real-time RT-PCR法），用室內(nèi)自配RT-PCR(in-house RT-PCR法)試劑的實(shí)驗(yàn)室只有12.2%(5/41)。各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果差異較大，僅31.7%(13/41)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全相符（100分），29.3%(12/41)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力有待進(jìn)一步提高（＜90分）。23個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告了假陰性結(jié)果，其假陰性率為7.3%(101／1.39

7、4)，EV71的檢測(cè)敏感性(82.1%)明顯低于EV(97.4%)或CA16(95.1%)(P＜0.05)。因此，本研究表達(dá)的VLPs完全可以替代病毒作為室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的樣本，全國(guó)HFMV分子檢測(cè)的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室在HFMV分子診斷方面有較為明顯的不足之處，如一些商業(yè)試劑盒的低敏感性和個(gè)別參與實(shí)驗(yàn)室的低檢測(cè)能力。因此，EQA應(yīng)該作為一項(xiàng)長(zhǎng)期的工作被定期嚴(yán)格執(zhí)行，以幫助監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室在HFMV的檢測(cè)能力和提高來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的一致性，使之具有可比性

8、。另外，由于RNA病毒的易突變性，在以后的EQA樣本中還應(yīng)該增加HFMV更多的基因型。
　　 用RNA替代DNA作為基因疫苗是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)和趨勢(shì)，因?yàn)镽NA不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組，也不會(huì)引起自身免疫病等嚴(yán)重的副作用。當(dāng)前mRNA疫苗的研究主要集中在治療性腫瘤疫苗和免疫治療的研究。釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)的包裝外源功能性mRNA的MS2VLPs具有使RNA穩(wěn)定、高體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率和安全的特性。本課題的前期研究已經(jīng)證明，基于MS2噬菌體衣

9、殼蛋白的VLPs可作為mRNA新型遞送載體，免疫小鼠后可誘導(dǎo)針對(duì)編碼該mRNA表達(dá)蛋白的特異性抗體的產(chǎn)生。因此，本項(xiàng)研究采用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得重組MS2VLPs作為腫瘤治療性mRNA疫苗的新型遞送載體，MS2VLPs內(nèi)裝載有腫瘤相關(guān)抗原如癌胚抗原(carcino embryonic antigen,CEA)編碼mRNA(CEA-RNA)。建立小鼠結(jié)腸癌動(dòng)物模型和轉(zhuǎn)CEA基因動(dòng)物模型，來(lái)研究其誘導(dǎo)的免疫效果和免疫保護(hù)能力。第二部分旨在研

10、究?jī)?nèi)含癌胚抗原(CEA)-mRNA的MS2VLPs的真核表達(dá)及其作為結(jié)直腸癌治療性疫苗的研究。本研究將編碼CEA蛋白的cDNA序列插入pMS2構(gòu)建能包裝CEA mRNA的pMS2-CEAVLPs的表達(dá)載體。經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母YPH499細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)MS2 VLps。純化后，采用瓊脂糖凝膠電泳和電子顯微鏡鑒定，并對(duì)上述VLPs進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證VLPs是否包裝了全長(zhǎng)的CEA-RNA。提取pMS2-CEA

11、 VLPs包裝的RNA，使用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使用Western Blot法檢測(cè)CEA蛋白的表達(dá)，同時(shí)計(jì)算pMS2-CEA VLPs誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)MC38-CEA細(xì)胞的殺傷率。取50μg純化的pMS2-CEA VLPs，免疫6-8周C57BL/6小鼠和結(jié)直腸癌模型小鼠。三次免疫后取小鼠尾靜脈血用ELISA法檢測(cè)抗原特異性抗體的產(chǎn)生和用ELISPOT法檢測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平(IFN-γ)以及觀察荷瘤小鼠的生存時(shí)間。

12、r>　　 研究結(jié)果表明，采用單質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，在釀酒酵母YPH499細(xì)胞內(nèi)MS2衣殼蛋白成功的包裝了CEA mRNA，形成了MS2-CEA VLPs。提取RNA轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞（MC38細(xì)胞和CHO細(xì)胞）后可檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)；在效靶比為20∶1和40∶1時(shí)，pMS2-CEA VLPs誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)MC38-CEA細(xì)胞的殺傷率分別為38.7%和43.6%，而對(duì)MC38細(xì)胞的無(wú)明顯殺傷作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。我們還進(jìn)一

13、步證實(shí)了純化后的pMS2-CEA VLPs免疫C57BL／6小鼠后，可以誘導(dǎo)抗原特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并對(duì)荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用。另外觀察腫瘤組小鼠的生存時(shí)間發(fā)現(xiàn)，免疫組小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了MS2 VLPs的釀酒酵母表達(dá)載體pMS2-CEA，并證實(shí)釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可成功地表達(dá)MS2 VLPs。同時(shí)也證明了釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)的MS2 VLPs可作為mRNA的新型遞送載體，可以誘導(dǎo)抗原特異性體液免疫