纖維素酶作為融合蛋白在大腸桿菌中的應用及其分泌機制的研究.pdf

1、大腸桿菌的遺傳系統(tǒng)操作簡便，遺傳背景清晰，技術手段成熟，是目前較常用的蛋白表達菌株，多用于重組蛋白及藥物蛋白的生產。但是在實際應用中，除了缺少翻譯后的修飾系統(tǒng)外，大腸桿菌在表達異源蛋白時會由于積累大量錯誤折疊的目的蛋白，形成難以復性的包涵體結構。為了解決這個問題，研究人員提出了一系列的解決方法，如使用不同的啟動子調控蛋白的表達水平、共表達分子伴侶、降低培養(yǎng)溫度或者將目的蛋白以融合蛋白的形式分泌到菌體周質空間或胞外表達。
　　其中，

2、融合蛋白的分泌表達具有很多優(yōu)勢，例如簡化了下游純化程序，避免了蛋白酶的降解，周質空間的環(huán)境利于蛋白質的正確折疊，并且胞外積累目的蛋白可以減少對菌體代謝及生長的抑制作用等。在生物質能源轉化方面，由于纖維素類的大分子底物無法直接被大腸桿菌菌體轉運至胞內分解利用，重組酶的胞外分泌表達也是成功的關鍵因素。
　　但是，在革蘭氏陰性菌中蛋白質的分泌需要穿過兩層膜結構。因此，大腸桿菌在實驗室培養(yǎng)條件下并不具有很強的分泌能力。融合載體蛋白的選擇不

3、僅決定了目的蛋白的轉運位置，也影響到了目的蛋白的最終分泌量。目前較常用的融合蛋白載體主要有兩類:1）信號肽序列，可以將目的蛋白特異性的轉運至周質空間，如Sec途徑信號肽及TAT途徑信號肽序列;2）大腸桿菌中過表達檢測到的可分泌蛋白，一般可以通過某一未知的外膜途徑將目的蛋白攜帶分泌至胞外，如內源性蛋白OsmY，YebF等。
　　本文利用之前研究中所發(fā)現(xiàn)的一個于芽孢桿菌的纖維素酶催化結構域(Cel-CD)，在大腸桿菌中過表達時可以被高

4、效的分泌至胞外，具有作為融合載體蛋白的應用前景。所以選定Cel-CD作為本研究的目標蛋白驗證其在融合蛋白分泌表達方面的應用，并通過進一步對Cel-CD在大腸桿菌中的分泌機制的檢測確定了Cel-CD的N端氨基酸對于其可溶性表達及分泌的作用。隨后，利用Cel-CD分泌表達融合蛋白的特性及其自身的纖維素內切酶活性構建了可將纖維素類物質轉化為PHB的細胞工廠。
　　一、Cel-CD高效分泌表達的機理研究
　　由于在前期實驗中已經驗證

5、Cel-CD的分泌是經過周質空間的兩步法過程，并且是不依賴于自身原始信號肽序列的。Cel-CD自身序列的N端20個氨基酸同時起到了穿內膜及外膜分泌的信號肽作用。
　　通過前期的氯霉素抑制SecA蛋白活性實驗以及本章節(jié)利用N20融合GFP蛋白的熒光實驗檢測，確認Cel-CD在大腸桿菌中是通過SecB依賴的Sec途徑穿內膜到達大腸桿菌的周質空間。而大腸桿菌外膜上存在的兩步法分泌孔道主要有二型分泌系統(tǒng)(T2SS)，五型分泌系統(tǒng)(T5SS

6、)及外膜蛋白(OMPs)。通過敲除E.coli BL21(DE3)菌株相關蛋白的基因后檢測Cel-CD的胞外積累，發(fā)現(xiàn)Cel-CD的分泌并沒有受到抑制。因此，推斷Cel-CD在大腸桿菌中通過某一未知的途徑分泌到胞外。
　　由于在對Cel-CD序列分析時，發(fā)現(xiàn)其不具有各型分泌系統(tǒng)的信號肽序列性質，也沒有相關的信號肽酶酶切位點。將N20與其他常用的Sec途徑信號肽進行序列比較，發(fā)現(xiàn)N20的n-region帶有負電荷，整個N20的二級結

7、構預測顯示為無規(guī)則卷曲并且具有明顯的親水性及極性，并不具有傳統(tǒng)信號肽的n-region、h-region及c-region的特征。
　　為了檢測N20序列上對Cel-CD分泌起關鍵作用的氨基酸位點，利用隨機誘變試劑盒對N20序列進行隨機誘變，檢測突變株胞外分泌量的變化。由于大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，具有雙層膜結構，誘變株的分泌量變化既受穿內膜效率變化的影響也受穿外膜效率變化的影響。誘變結果顯示，N20氨基酸序列疏水性提高及二級結構

8、的改變（生成α-螺旋）都會引起穿內膜分泌量的提高，但外膜分泌受到一定程度的抑制。通過與其他可分泌蛋白的N端的替換實驗也進一步驗證了上述結論。以上結果說明，N20的分泌信號肽作用是折中了內膜及外膜分泌條件的結果。
　　二、Cel-CD作為融合蛋白的應用
　　在章節(jié)中，以Cel-CD為目標蛋白檢測其在大腸桿菌中的應用。首先構建了Cel-CD的表達載體，發(fā)酵檢測其在大腸桿菌中的分泌。通過DNS法檢測胞外Cel-CD酶活，證明分泌到

9、胞外的Cel-CD具有纖維素內切酶酶活。并通過電鏡檢測，證明表達菌體細胞膜完整，排除了菌體裂解對胞外Cel-CD積累的影響。也排除了Cel-CD的酶活對菌體細胞膜通透性造成的影響。
　　前期通過N端的缺失實驗，已經驗證了Cel-CD的N端20個氨基酸對于其胞內可溶性表達及分泌起到了重要作用。在本章節(jié)中，進一步通過N端20個氨基酸殘基與PelB的替代實驗，證明了N端20個氨基酸同時起到了穿內膜及外膜分泌的信號肽作用。
　　隨后

10、，選取了5組不同來源的蛋白質與Cel-CD及N20融合表達，以驗證Cel-CD及N20是否具有攜帶底物蛋白可溶性表達及分泌的能力。通過對各發(fā)酵組上清的檢測，發(fā)現(xiàn)Cel-CD與底物蛋白的融合可以有效的提高其在大腸桿菌中的可溶性表達，并可以將5組目的蛋白全部攜帶分泌至胞外，但是分泌效率受底物蛋白分子量的影響較大。而N20融合5組不同來源的底物蛋白后，對其可溶性的提高影響并不明顯，但是在可溶性表達的基礎上，均可以將底物蛋白融合攜帶至胞外。進一

11、步檢測了融合蛋白表達菌株的生長狀態(tài)，與對照組相比，Cel-CD及N20融合蛋白對于菌體生長并沒有明顯的影響。結合以上實驗結果，認為Cel-CD及N20均具有在大腸桿菌中作為載體蛋白分泌表達的能力，但適用范圍不同。
　　為了進一步增加融合蛋白的可溶性及分泌效率，嘗試對培養(yǎng)基以及N端信號肽拷貝數(shù)做了優(yōu)化。文獻報道，TB培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富并富含磷酸鹽緩沖體系。使用TB培養(yǎng)基代替LB發(fā)酵檢測N20融合蛋白的可溶性表達及分泌。結果顯示，TB培養(yǎng)

12、基針對原本就可溶的N20融合蛋白的可溶性表達具有促進作用，并可以進一步增加其分泌量。但對于不可溶的N20融合蛋白并沒有顯著作用。結果進一步說明了N20融合對于底物蛋白可溶性并沒有顯著的促進作用，但可以較高效的將目的蛋白攜帶分泌至胞外。
　　由于N20具有穿內外膜信號臺作用，為了提高信號強度，在N20序列的N端又增加了PelB信號肽序列以增加N端的信號肽序列數(shù)。選取了與N20后僅胞內可溶性表達的堿性磷酸酶作為底物蛋白進行發(fā)酵檢測。實

13、驗結果顯示，添加了pelB信號肽的實驗組可以通過周質空間被進一步分泌至胞外。因此，認為增加N端信號肽數(shù)目對于N20融合蛋白的分泌能力具有較好的促進作用，但其適用范圍還需要進一步的試驗證明。
　　三、Cel-CD作為雙功能蛋白的應用
　　在前期的實驗中，已經驗證分泌到胞外的Cel-CD具有較好的纖維素內切酶活性，并且具有攜帶其他目的蛋白分泌到胞外的能力。利用Cel-CD作為融合載體蛋白，選取了來源于嗜熱裂胞菌的β-葡聚糖苷酶T

14、fu0937與其融合表達。在大腸桿菌中，融合蛋白Cel-Tfu0937可以被高效的分泌至胞外。通過酶活檢測融合蛋白的胞外活性，發(fā)現(xiàn)既有纖維素內切酶活性也具有β-葡聚糖苷酶活性。因此具有構建大腸桿菌纖維素細胞工廠的潛力。
　　PHB是一類可以被生物降解的聚酯，因此被廣泛的應用于各個領域。在融合蛋白表達菌株中引入一條PHB合成途徑——包含有乙酰乙酯輔酶A、β-酮硫酶以及PHB合酶的質粒，作為纖維素發(fā)酵利用的驗證產物。選取了纖維素類物質

15、CMC作為發(fā)酵底物，在不添加葡萄糖的培養(yǎng)基內發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體檢測到了少量的PHB積累。結果證明，構建了一株可以利用纖維素類物質生產PHB的大腸桿菌，提供了一株有效利用纖維素為唯一碳源積累生物能源物質的基礎菌株。
　　進一步使用纖維素類物質的酶解產物——纖維二糖，作為唯一碳源做發(fā)酵檢測。由于體系中不再需要纖維素內切酶的作用，構建了N20-Tfu0937融合蛋白，并檢測到了胞外蛋白分泌及相應的β-葡聚糖苷酶酶活。不添加葡萄糖的培養(yǎng)基