促紅細(xì)胞生成素衍生肽抑制小鼠糖尿病心肌病損傷的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的特點。心血管系統(tǒng)并發(fā)癥是糖尿病患者的主要并發(fā)癥，并且是其主要致死原因。心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的嚴(yán)重危害及其帶來的巨額醫(yī)療費用已經(jīng)成為全球性公共衛(wèi)生難題。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）主要由腎臟合成，是一種能夠刺激骨髓造血的糖蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，除促進(jìn)造血作用外，EPO還可對心臟、神經(jīng)、腎臟等多組織器官發(fā)揮保護(hù)作用。然而，EPO發(fā)揮組織保護(hù)作

2、用所需要的臨床劑量較大，而其本身具有促紅細(xì)胞生成的作用，因而增加了促血栓形成、中風(fēng)、高血壓等副作用的風(fēng)險，從而限制了EPO的臨床應(yīng)用。促紅細(xì)胞生成素衍生肽（Helix B Surface Peptide，HBSP）是促紅細(xì)胞生成素的衍生物，亦即螺旋B表面肽。它是由EPO的B螺旋親水性表面的11個氨基酸殘基組成的線性小分子多肽。研究發(fā)現(xiàn)，HBSP可與“組織修復(fù)受體”，即EPOR-βCR相結(jié)合而發(fā)揮組織保護(hù)作用，并且不會促進(jìn)紅細(xì)胞生成。近年

3、研究發(fā)現(xiàn)，HBSP在腦神經(jīng)、視網(wǎng)膜、腎臟、心肌等組織中有保護(hù)作用。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）廣泛存在于真核生物中，參與自噬、細(xì)胞能量代謝等多種生物學(xué)活動。研究表明，HBSP可以通過激活 AMPK，上調(diào)自噬從而保護(hù)小鼠腎臟缺血/再灌注損傷。然而，HBSP在1型糖尿病導(dǎo)致的心肌損傷中的作用和機(jī)制目前尚不明確。最近研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病引起的小鼠糖尿病心肌病模型中，可觀察到心肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，提示心肌自噬的下調(diào)可能

4、參與高血糖導(dǎo)致的心肌損傷。目前尚無研究表明HBSP對高血糖時心肌自噬變化的影響。
　　因此，我們想探究如下問題：（1）HBSP對于1型糖尿病導(dǎo)致的心肌損傷是否具有保護(hù)作用？（2）該作用是否與AMPK依賴的自噬上調(diào)有關(guān)？
　　研究目的：
　　觀察HBSP對1型糖尿病誘導(dǎo)的糖尿病心肌病小鼠的心功能、心肌細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化、心肌超微結(jié)構(gòu)、心肌自噬等的影響，并且觀察 HBSP對高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位、細(xì)

5、胞自噬水平的影響，并進(jìn)一步探討 HBSP是否通過AMPK依賴的自噬激活而減輕糖尿病心肌病損傷。從而為糖尿病心肌病的臨床防治提供新的思路。
　　研究方法：
　　采用腹腔注射STZ的方法構(gòu)建小鼠1型糖尿病模型，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建糖尿病心肌病模型。小動物超聲檢測心功能、ELISA法檢測小鼠心肌炎癥因子TNF-ɑ、IL-6的表達(dá)、透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)、天狼星紅檢測心肌間質(zhì)纖維化，通過LC3免疫熒光和 western blot法檢測

6、各組小鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。以33mmol/L的高濃度葡萄糖培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞48小時，經(jīng)HBSP（100nM）、自噬抑制劑3-MA（10mM）、自噬激活劑 Rapamycin（Rapa，100nM）和 AMPK抑制劑compound c（CC，10mM）分組干預(yù)后，采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡、JC-1染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位、透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體，western blot法檢測LC3Ⅱ/Ⅰ、p62等自噬標(biāo)志蛋白以及

7、AMPK和mTOR的磷酸化水平。
　　研究結(jié)果：
　?。?）糖尿病心肌病小鼠心功能減退、心肌細(xì)胞凋亡增加、心肌組織TNF-ɑ和IL-6的表達(dá)增加、心肌超微結(jié)構(gòu)受損、心肌間質(zhì)纖維化程度增加、心肌組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降、p62表達(dá)增加。而HBSP可部分逆轉(zhuǎn)上述改變（P＜0.05）。（2）與低糖組相比，高糖培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡比例明顯增加、線粒體膜電位水平明顯下降，LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降、p62表

8、達(dá)增加，AMPK磷酸化減少、mTOR磷酸化增加（P＜0.05）。
　?。?）HBSP可以減輕高糖導(dǎo)致的H9C2心肌細(xì)胞的凋亡比例、提高線粒體膜電位，降低高糖導(dǎo)致的p62的上調(diào)和mTOR磷酸化的增加，增加LC3Ⅱ/Ⅰ的比值和AMPK的磷酸化（P＜0.05）。
　　（4）自噬抑制劑3-MA可部分抵消HBSP的細(xì)胞保護(hù)作用，而自噬激動劑Rapamycin對高糖培養(yǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用（P＜0.05）；AMPK抑制劑CC可部分