具有高PPARγ激動(dòng)活性的新型血管素受體阻斷劑 Tek-2 藥理學(xué)研究.pdf

1、心腦血管疾病是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高、死亡率最高的疾病，在心腦血管疾病的誘發(fā)因素中，高血壓及其并發(fā)癥占據(jù)著重要地位。最新調(diào)查顯示，目前中國(guó)已有3億左右高血壓患者，發(fā)病率大約為25％，且每年新增1000萬(wàn)例。由于高血壓存在患病率高、致殘率高、致死率高，知曉率低、控制率低等特點(diǎn)，因而高血壓及其并發(fā)癥時(shí)刻威脅著人類的健康，給人們的生活以及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。
　　有效地控制血壓及其相應(yīng)的并發(fā)癥對(duì)降低心腦血管疾病的致殘率、致死率都具有重

2、要的意義。目前抗高血壓的臨床一線藥物主要有：鈣離子拮抗劑、β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素受體拮抗劑（Angiotensin Recepter Blockers,ARBs）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。其中，ARBs降壓療效確切，副作用少，病人耐受性好。在所有的抗高血壓藥物中，ARBs是唯一能夠在發(fā)揮降壓作用的同時(shí)，并提供心、腦、腎等終末器官的保護(hù)作用的藥物。這對(duì)于更加全面地改善心腦血管疾病具有重要意義。
　　近年來(lái)，隨著對(duì)ARBs的

3、藥理學(xué)研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其靶器官的保護(hù)作用不僅僅與其阻斷AT1受體（Angiotensin II Type1 Receptor，AT1）相關(guān)，而且與激活過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorsγ，PPARγ)密不可分。能夠同時(shí)具有阻斷AT1受體以及激活PPARγ受體，是其他抗高血壓藥所不具備的特質(zhì)。以前的研究認(rèn)為，ARBs降壓的作用機(jī)制僅僅是通過阻斷AT1受

4、體，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-Angiotensin-System,RAS）的過度激活，產(chǎn)生降壓效果。而目前研究表明，ARBs通過激動(dòng)PPARγ同樣可以產(chǎn)生輕微的降壓作用，并且PPARγ激活后，伴隨出現(xiàn)調(diào)節(jié)脂糖代謝、改善腦卒中、改善認(rèn)知等藥理學(xué)作用，使得ARBs的臨床應(yīng)用前景更加廣闊。
　　ARBs目前臨床上應(yīng)用的主要是沙坦類藥物，目前國(guó)內(nèi)外上市的共有8種，在這8種藥物中，替米沙坦生物利用度高，半衰期最長(zhǎng)，且是唯一在治

5、療劑量下即有PPARγ激動(dòng)作用的沙坦類藥物?；趯?duì)替米沙坦的多樣生物活性與其分子結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系研究，本課題組以替米沙坦作為先導(dǎo)化合物，通過結(jié)構(gòu)修飾改善其物理化學(xué)性質(zhì)，增加其脂溶性，得到了第一代化合物Tek-1。研究發(fā)現(xiàn)，化合物Tek-1具有阻斷AT1受體與部分激動(dòng)PPARγ的作用，水平與替米沙坦相當(dāng)，但脂溶性高于替米沙坦?；谝陨涎芯?，本文評(píng)價(jià)了Tek-1的體內(nèi)降壓效果，證實(shí)其具有良好降壓生物學(xué)活性；在此基礎(chǔ)上，我們又以Tek-1為

6、先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)合成了全新結(jié)構(gòu)的系列化合物，希望提高Tek-1的PPARγ激動(dòng)活性。通過對(duì)其藥理學(xué)作用特點(diǎn)的系統(tǒng)研究，本文獲得具有良好降壓效應(yīng)，并具有高PPARγ激動(dòng)活性的多功能新一代ARBs的候選化合物。
　　本論文研究的主要發(fā)現(xiàn)包括：
　　1、先導(dǎo)化合物Tek-1的體內(nèi)降壓效應(yīng)研究
　　為了給第二代Tek類降壓藥進(jìn)行分子設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)，本文首先在自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensiv

7、e rats,SHRs）上，采用灌胃給藥，研究了Tek-1連續(xù)給藥4周（每7天測(cè)量一次血壓）對(duì)各組大鼠血壓的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組SHRs血壓相比，替米沙坦（5、10mg/kg）和Tek-1（1、5、10mg/kg）在各個(gè)劑量下均能顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓和舒張壓（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）；降壓效應(yīng)與給藥劑量呈劑量依賴性，給藥劑量越高，血壓下降幅度越大；10mg/kg替米沙坦降壓效應(yīng)

8、最強(qiáng)，10mg/kg Tek-1降壓效應(yīng)與5mg/kg替米沙坦降壓效應(yīng)相當(dāng)。
　　2、新化合物Tek-2、Tek-3的體外藥理學(xué)作用研究
　　在確認(rèn)Tek-1的整體降壓活性及其他藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，以Tek-1為先導(dǎo)分子設(shè)計(jì)合成新化合物Tek-2、Tek-3，并對(duì)其開展了分子藥理學(xué)作用研究。
　　2.1 新化合物Tek-2和Tek-3對(duì)PPARγ的激動(dòng)活性及選擇性研究
　　通過構(gòu)建PPARγ報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，并利

9、用該系統(tǒng)評(píng)價(jià)化合物 Tek-2和Tek-3對(duì)PPARγ激動(dòng)效應(yīng)。結(jié)果顯示，替米沙坦在濃度為1、10μM時(shí)對(duì)PPARγ激活倍數(shù)分別為1.30±0.07(P＜0.05)和1.27±0.01(P＜0.05)；0.1、1、10μM Tek-2亦能夠濃度依賴地激活PPARγ受體，相應(yīng)藥物濃度下Tek-2激活倍數(shù)分別為1.34±0.12(P＜0.01)、1.46±0.08(P＜0.01)和1.44±0.04(P＜0.01)，而新化合物Tek-3在各

10、個(gè)濃度下對(duì)PPARγ受體沒有顯著性激活作用。Tek-2在各個(gè)濃度下對(duì)PPARγ的激動(dòng)活性有高于陽(yáng)性藥替米沙坦的趨勢(shì)，且在10μM時(shí)激活百分比為22.7±4.2%，顯著高于替米沙坦（11.9±2.4%）（P＜0.05)。進(jìn)一步通過構(gòu)建PPARα報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行PPAR選擇性研究。利用該系統(tǒng)評(píng)價(jià)替米沙坦、Tek-2和Tek-3的PPARα激動(dòng)活性。結(jié)果顯示，替米沙坦、Tek-2和Tek-3在各個(gè)濃度下均對(duì)PPARα受體沒有顯著性激活作用

11、。
　　2.2 新化合物Tek-2對(duì)AT1受體親和力的研究
　　通過[125I]-AngⅡ放射性受體配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)替米沙坦和Tek-2對(duì) AT1受體的親和力。Tek-2對(duì)大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞上AT1受體與[125I]-AngⅡ的結(jié)合具有較強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，Tek-2和替米沙坦的Ki值分別為9.25±1.08nM和3.35±0.7nM，結(jié)果表明Tek-2對(duì)AT1受體具有較高的親和力，與替米沙坦相當(dāng)。
　　2.3 新化

12、合物Tek-2對(duì)AT1受體內(nèi)在拮抗活性研究
　　利用穩(wěn)轉(zhuǎn)AT1受體的HEK-Gα15細(xì)胞，評(píng)價(jià)Tek-2對(duì)AT1受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的作用。結(jié)果表明，替米沙坦和Tek-2在0.0128-1000nM濃度下，化合物本身對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放無(wú)影響；但替米沙坦和Tek-2對(duì)AngII誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放具有明顯的拮抗作用，IC50值分別為0.7±0.11nM和2.28±0.24nM。由此可見， Tek-2是AT1受體的高選擇性拮抗劑，拮抗活性

13、略低于替米沙坦。
　　3、新化合物Tek-2的體內(nèi)藥理學(xué)作用研究
　　3.1 Tek-2能夠明顯降低SHRs血壓
　　在SHR模型上，灌胃給藥Tek-2，觀察Tek-2對(duì)1-4周大鼠血壓的影響。結(jié)果顯示，替米沙坦（5、10mg/kg）和Tek-2（2.5、5、10mg/kg）均能顯著降低SHRs收縮壓和舒張壓（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），降壓效應(yīng)與給藥劑量呈劑量依賴性；10m

14、g/kg替米沙坦降壓效應(yīng)最強(qiáng)，10mg/kg Tek-2降壓效應(yīng)與5mg/kg替米沙坦降壓效應(yīng)相當(dāng)。
　　3.2 Tek-2能夠明顯降低tMCAO小鼠腦梗死體積并發(fā)揮抗炎作用
　　為了評(píng)價(jià)Tek-2是否具有改善腦卒中、發(fā)揮腦保護(hù)的作用，我們采用短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞（transcient middle cerebral occlusion，tMCAO）模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，tMCAO組小鼠腦梗死體積增加13.

15、02±1.15%（P＜0.01），證明小鼠tMCAO模型構(gòu)建成功。通過氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色發(fā)現(xiàn)替米沙坦10mg/kg、Tek-25mg/kg和Tek-210mg/kg組腦梗死體積分別為7.32±1.07%、8.45±0.57%、5.95±0.52%，與tMCAO模型組小鼠相比，腦梗死體積均顯著減少（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）；10mg/kg Tek-

16、2組tMCAO小鼠腦梗死體積顯著性低于替米沙坦組（P＜0.05），而5mg/kg Tek-2組與10mg/kg替米沙坦組相當(dāng)。當(dāng)側(cè)腦室給予 PPARγ拮抗劑 GW9662后，10mg/kg替米沙坦和Tek-2組tMCAO小鼠腦梗死體積分別為8.45±1.03%和9.06±1.05%，分別與未給予GW9662前組相比，10mg/kg Tek-2組梗死體積增加，有顯著性差異（P＜0.05），而10mg/kg替米沙坦組梗死體積與其相當(dāng)，無(wú)顯著

17、性差異。以神經(jīng)損傷評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)tMCAO小鼠行為變化進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，與tMCAO模型組相比，10mg/kg替米沙坦、5mg/kg Tek-2和10mg/kg Tek-2各組神經(jīng)損傷評(píng)分明顯降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。與10mg/kg Tek-2組相比， GW9662+Tek-210mg/kg組神經(jīng)損傷評(píng)分顯著升高（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，Tek-2減少梗死體積和改善神經(jīng)損傷的作用與其激活PPARγ

18、有關(guān)。
　　進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)，檢測(cè)各處理組小鼠梗死側(cè)大腦皮層半暗區(qū)內(nèi)炎性因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） mRNA表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)10mg/kg替米沙坦處理組TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；

19、10mg/kg Tek-2能夠抑制tMACO模型TNF-α、IL-6和iNOS mRNA表達(dá)水平上調(diào)，均具有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明Tek-2發(fā)揮抗炎作用可能是其改善腦卒中的重要機(jī)制。
　　綜上所述，本研究獲得了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新化合物Tek-2。通過體外藥理學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)Tek-2比替米沙坦具有更高的選擇性PPARγ激動(dòng)活性；通過體內(nèi)藥理學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)Tek-2具有良好的體內(nèi)降壓效應(yīng)，并在tMCAO